2018 Fiscal Year Annual Research Report
結合タンパク質の網羅的な解析を指向したタンパク質ラベル化法の開発
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18J21621
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
對馬 理彦 東京工業大学, 生命理工学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | タンパク質ラベル化 / Ru光触媒 / キナーゼ / レクチン / 分子標的同定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はキナーゼのように数百種類の標的が存在するような複雑な系ではなく、よりシンプルな標的を用いて実験系の確立を行った。具体的には糖に結合するタンパク質群であるレクチンをモデルとして研究を進めた。レクチンは糖との親和性が数百μMであるため本タンパク質をラベル化・同定できれば、リガンドとの親和性の弱いキナーゼも解析対象にできると期待した。ラクトース誘導体およびRu光触媒担持ビーズを用い、細胞破砕液中でラベル化を行い、トリプシン消化後、LC-MS/MS解析によって同定した。するとラクトース結合タンパク質としてgalectin-1およびgalectin-3が同定された。これらのタンパク質は前述したとおりラクトースとの結合力が数百μMであり従来法での検出は難しい。実際にgalectin-1およびgalectin-3は標的同定法として汎用されるアフィニティークロマトグラフィーで精製することができなかった。一方で、ビーズ上で共有結合形成を行う本法を2D-DIGE法へ応用したところ、蛍光ラベル化されたgalectin-1およびgalectin-3を検出可能であることを見出した。以上から、ラベル化したタンパク質をLC-MS/MS解析や2D-DIGEで解析するための実験系を確立するとともに、従来法では検出が困難であったタンパク質を同定することに成功した。本手法でキナーゼ阻害剤を用いれば、従来では検出が困難であったキナーゼも解析対象にでき、従来法では解明できなかった疾患や薬剤の副作用解明につなげることができると考えている。また、ラベル化効率の向上を目指しラベル化剤の改良も行った。Urazoleの骨格をもとに、誘導体化を行ったところ、従来までの1-methyl-4-arylurazoleよりも効率よく標的タンパク質をラベル化可能な1-methyl-4-alkylurazoleの構造を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者は本年度、アフィニティービーズ上でラベル化したタンパク質を同定するための実験系を確立した。そのモデル実験の中で、申請者の開発した手法は従来法のアフィニティークロマトグラフィーで検出が困難なタンパク質を同定できることが明らかとなってきた。この手法を研究計画にあるキナーゼ阻害剤や他の生物活性物質に応用することができれば、従来法では難しかった結合力の弱いキナーゼを解析対象にすることが可能であるため、本手法は未知の標的タンパク質や作用機序解明を可能にできると大きく期待している。また、上記以外にも本ラベル化技術の改善のためにラベル化剤の合成・評価に着手した。何種類もの化合物を合成・評価することによって従来のラベル化剤よりも効率よくラベル化が可能な新規タンパク質ラベル化剤1-alkyl-4-arylurazoleを見出すことに成功した。今後は当初の研究計画にあるラベル化触媒の開発に引き続き従事し、従来のRu光触媒以上の高効率光触媒の発見が期待される。以上のことからおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
光触媒の酸化還元電位はラベル化効率を左右する重要なファクターである。従来までの検討ではタンパク質の非特異的な吸着を抑制することが可能なRu/dcbpy錯体を光触媒として用いてきた。今後は更なる効率向上を目指し、光触媒の検討を行う。具体的には種々の有機光触媒を検討する。近年有機光触媒は盛んに研究されてきており、様々な酸化還元電位を有する有機光触媒の構造が種々報告されている。種々の触媒構造を用いてラベル化を検討し、適切な酸化還元電位を持つ触媒を選定する。選定されてきた触媒と前年度見出した1-methyl-4-alkykurazoleを用いてキナーゼ阻害剤に結合するタンパク質のラベル化を行う。Ru担持ビーズ上にキナーゼ阻害剤を担持するために、キナーゼ阻害剤-リンカー分子の合成に着手する。合成したキナーゼ阻害剤と光触媒をビーズに固定化し、細胞破砕液中でラベル化・精製を行う。細胞株によって発現するタンパク質が異なるため、MDA-MB-468細胞、A431細胞、SK-BR3細胞など種々の細胞破砕液を検討する。ラベル化されるタンパク質の同定、ラベル化サイトの同定はデスチオビオチンをラベル化で導入し、アビジンビーズを用いた精製後、トリプシン消化、LC－MS/MS解析により行う。
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