2019 Fiscal Year Annual Research Report
Proteolysis-based targeting of transcription factor RUNX1 using Ubiquitin-Proteasome pathway
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18J22111
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
米澤 大志 東京大学, 新領域創成科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | RUNX1 / STUB1 / DTX2 / ユビキチン化 / サーマルシフトアッセイ / PROTACs / 造血器腫瘍 / 治療薬開発 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
A:申請者らは”PROTACs”という手法を用いてRUNX1依存性白血病の治療薬か開発に取り組んでいる。計算化学、構造生物学、及びタンパク質工学的手法より、RUNX1及び基質E3リガーゼSTUB1にそれぞれ結合する化合物の探索を行った。その結果、RUNX1又はSTUB1各々に結合する化合物を見つけ出す事に成功した。以上の成果は、標的タンパク質の分解誘導剤作成の基盤となる化合物であり、RUNX1-STUB1 PROTACsが作成されれば、多くの造血器腫瘍並びに固形癌に適応できると考えられ、臨床応用にむけて重要な意義を持つ。
B:申請者らは、RUNX1の基質E3リガーゼを同定する際にRUNX1非分解型E3リガーゼRNF38及びDTX2を同定している。昨年度は、E3リガーゼであるDTX2に関しての解析を進めてきた。その結果、DTX２はRUNX1の分解誘導を誘導しないものの、RUNX1の核外移行を誘導し、RUNX1の活性を低下させる事を見出した。また、更なる詳細な解析を進めた所、RUNX1の24と43番リジン残基のユビキチン化を誘導する事で、競合的に、RUNX1自身の活性及びDNAの結合に重要なアセチル化の低下を起こす事を発見した。以上の研究成果は、研究実施計画と照らし合わせても順調に進行しているといえる。また、RUNX1は造血細胞の発生及び分化に重要であるが、翻訳後修飾の一つであるユビキチン化において、ユビキチン-プロテアソーム系による分解以外の知見は、詳細には調べられていなかった。したがって本研究で示された、DTX2によるRUNX1非分解型ユビキチン制御機構は、RUNX1の翻訳後修飾における役割に関して、重要な知見となる。また、RUNX1の活性を下げることは、多くの造血器腫瘍並びに固形癌に対して有効な治療法となることから、新規治療法開発に向けても重要性を含む結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
A:当該年度は、RUNX1の分解誘導を行う“PROTACs”作成の為、RUNX1及び基質E3リガーゼSTUB1にそれぞれ結合する化合物の探索を行った。昨年度のドッキングシミレーションから選定した、タンパク質とのドッキングスコアが高い化合物上位１万個に対して、タンパク質と化合物が結合した際に生じる熱安定性から結合能を評価するアッセイ系 “サーマルシフトアッセイ”を用いてスクリーニングを行った。その結果、RUNX1又はSTUB1各々に結合する化合物を見つけ出す事に成功した。現在、同定した化合物とRUNX1又はSTUB1との結合力の評価や、RUNX1-STUB1 PROTACsの開発に向けた有機合成展開の準備を進めている。
B:我々は、RUNX1のユビキチン化を誘導するE3リガーゼの探索過程において、STUB1以外にもE3リガーゼRNF38及びDTX2がRUNX1のユビキチン化修飾を行う事を発見している。そこで、それらE3リガーゼによるRUNX1に対する機能解析が本研究のもう一つのテーマである。本年度は、主にDTX2に関して解析を行なった。その結果DTX2は、RUNX1のユビキチン化を介してRUNX1自身が持つ転写活性能に重要なアセチル化を低下させる事が分かった。また、DTX2の酵素活性を上昇させることで、RUNX1の転写活性能が低下し、さらに、興味深いことにRUNX1の核外移行を促進させることを見出した。また、DTX2の活性上昇は、RUNX1の発現に増殖が依存している腫瘍細胞株TF1及びJurkat細胞の増殖を抑制することも見出した。よって来年度は、E3リガーゼDTX2がどの様にしてRUNX1の核外移行を促進させ、さらには機能低下を引き起こしているのかを、詳細に検討したいと考えている。
以上、現在までの進捗状況は予定通りであり、概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
A:申請者らは"PROTACs”という手法を用いてRUNX1依存性白血病の新規治療薬開発に取り組んでいる。本年度は、RUNX1及びSTUB1各々に結合する化合物の解離定数をタンパク質との結合力をマイクロスケール熱泳動 (MST) アッセイを用いて算出する。さらに、化合物展開を行うために、タンパク質と化合物の共結晶構造を解析する。これらのデータを基に、結合能が高く合成展開しやすい化合物に対して、RUNX1-STUB1 PROTACsの合成を行う。また、完成した RUNX1-STUB1 PROTACsに対して、細胞レベルでのRUNX1ユビキチン化、分解誘導能、さらにはRUNX1依存性白血病細胞株の増殖抑制能を検討する。以上の研究計画を遂行し、RUNX1を標的とした治療薬として、前臨床及び臨床試験に繋げたいと考えている。
B:申請者らは、RUNX1の基質E3リガーゼを同定する際にRUNX1非分解型E3リガーゼRNF38及びDTX2を同定している。昨年度は、E3リガーゼDTX2に関しての解析を進めてきた。その結果、DTX２はRUNX1の分解を誘導しないものの、RUNX1の核外移行を促進し、RUNX1の活性を低下させる事を見出した。また、更なる詳細な解析を進めた所、RUNX1の24と43番リジン残基のユビキチン化を誘導する事で、競合的に、RUNX1自身の活性及びDNAの結合に重要なアセチル化の低下を起こす事を発見した。したがって本年度は、DTX2によるRUNX1への局在変化がアセチル化低下によるDNA結合の解離が原因だと考え、その影響をChIP-Seqなどを用いて検討したいと考えている。さらに、DTX2はRUNX1の活性を低下誘導することから、SunTagシステムを用いてDTX2の活性を上昇させた際の、RUNX1の分化誘導能への影響やRUNX1依存性白血病細胞株の増殖抑制能を検討する。
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