2018 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the Fibrillization Mechanism of an ALS-Related Protein SOD1
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18J22192
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
岩川 直都 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | superoxide dismutase 1 / Rheo-NMR / せん断力 / 構造安定性 / アミロイド線維 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内を模倣した混雑環境におけるフォールディング安定性の定量
高濃度の生体高分子で混雑した細胞内を模倣した条件でSOD1の構造安定性の定量を行った。まず、希薄環境および混雑環境において核オーバーハウザー測定を行い、SOD1の立体構造決定を行った結果、天然構造の大きな変化は存在しないことが明らかとなった。一方で、NMR緩和測定等を行うことにより、混雑環境では、フォールディングが不安定化することや、ループ構造のダイナミクスに変化が見られることが明らかとなった。実際の生細胞内においても同様にダイナミクスの変化が起こっており、これが線維形成開始と関連している可能性が考えられる。
線維形成過程における分子間相互作用解析
SOD1にせん断力を加え、線維形成を促進した条件でNMR緩和速度測定を行うと、横緩和速度の増加が見られた。特に、SOD1の片側の分子表面に存在する残基で大きな横緩和測定の増加が見られたことから、この分子表面を介した分子間相互作用が線維形成過程に存在することが示唆された。また、攪拌後の試料には数十nm程度の粒子径を持つオリゴマーの存在が確認されており、この相互作用は、先述の分子表面を介した天然構造とオリゴマーとの分子間相互作用が存在することを示唆するものである。
新たに出現するピークの帰属
これまでの研究により、せん断力を加えた条件では、静止条件においては見られないピークが出現することが明らかとなっている。これらのピークは1Hの化学シフトが8ppm付近に集中しており、変性構造に由来するものであると考えられたため、尿素により変性させたSOD1の主鎖シグナルの帰属を行った。その結果、Rheo-NMR測定により新たに出現するピークの多くは変性構造に由来するものであると帰属することに成功した。つまり、SOD1が線維形成する際、一度変性構造を経ることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、混雑環境における、SOD1の構造安定性に関して詳細な解析を行うことができた。また、混雑環境におけるSOD1の立体構造の決定にも成功した。一方、未だ生細胞内での研究データは得られていない。
Rheo-NMR法に関しては、横緩和測定により当初予定していた分子間相互作用の解析を行い、片側の分子表面を介したオリゴマーとの相互作用を確認した。これは蛍光法等、他の測定手法によっては得られない、原子分解能での情報を得られたという点で、非常に重要な知見が得られたと考える。
以上のように、多くの研究データが得られているが、論文投稿には至っていない。
以上より、本研究はおおむね順調に進展していると言えるであろう。
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| Strategy for Future Research Activity |
in-cell NMR法を用いた細胞内でのSOD1フォールディング安定性の定量
まずは、昨年度までに行った、細胞内を模倣した混雑環境のSOD1構造安定性への影響に関して、論文投稿を行う。続いて、実際の生細胞内に標識SOD1を導入し、R2緩和分散測定等を行うことにより、生細胞内環境が与えるSOD1の構造安定性への影響に関して定量する予定である。
Rheo-NMR法を用いたSOD1線維形成メカニズムの解明
これまでに明らかとなった、SOD1天然構造とオリゴマー間の相互作用をより詳細に解析するために、常磁性緩和促進法等を行う。このデータと昨年度までのデータをまとめて、論文投稿を行う。また、Rheo-NMR測定により生成する線維中におけるSOD1分子の立体構造を原子分解能で明らかにするために、13C/15N標識したSOD1線維の固体NMR測定を行う予定である。
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