ＲＮＡのｍ６Ａ修飾が体内時計の周期決定に関与する分子メカニズムの解明

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18J23089
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 伊藤 翔 京都大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Keywords: m6A修飾 / 体内時計 / Csnk1d

Outline of Annual Research Achievements

RNAのメチル化修飾であるm6A修飾は古くから存在が知られていたが、最近になりようやくその生理学的な重要性が明らかとなり、m6A修飾による遺伝子発現制御の仕組み解明が重要な課題となっている。
体内時計の制御はm6A修飾が関与する重要な生理機能の一つである。体内時計を制御する複数の時計遺伝子の中でも、Csnk1d遺伝子のmRNAは非翻訳領域において高頻度でm6A修飾されている。この領域を部分的に欠損させた遺伝子改変マウスはCsnk1dタンパク質が増加し、体内時計の周期が野生型マウスよりも長くなることをこれまでの研究で明らかにした（Fustin, Kojima, Itoh et.al., PNAS 2018 申請者は共同第二著者）。しかし、Csnk1dタンパク質が増加するメカニズムはまだ十分に解明されておらず、m6A修飾による遺伝子発現制御の仕組みを解明する上で重要である。そこで、m6A修飾の有無によりCsnk1dのmRNAに結合するタンパク質が変わるという仮説を立て、本年度は結合パターンが変化するタンパク質を検出するための実験手法の最適化を進めた。
まず、細胞内で作られるCsnk1dのmRNAに結合するタンパク質を回収する方法として、Csnk1dのmRNAに結合するDNAを用いる手法とCsnk1dのmRNAに結合する合成タンパク質を用いる手法を試みた。しかし、これらの手法はCsnk1dのmRNAを効率的に回収できないことが明らかとなった。
そこで、m6A修飾が有る状態と無い状態のCsnk1d m6A修飾周辺配列を人工的に合成し、それらに結合するタンパク質を検出する手法を検討した。その結果、この手法では効率的にmRNAと結合するタンパク質を回収することが出来ており、今後これらのタンパク質を網羅解析することでCsnk1dの発現を制御する分子が特定できる可能性がある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は二つの実験を進行した。一つ目は、Csnk1d mRNAのm6A修飾の有無に応じて結合パターンが変化するタンパク質が存在し、Csnk1dの発現を制御しているという仮説の検証のため、実験手法の最適化を行った。内在性Csnk1d mRNAをターゲットするRAP-MS法、内在性Csnk1d mRNAに結合する亜鉛フィンガータンパク質を利用するプルダウン法と比較して、Csnk1d mRNAの配列を人工的に合成して合成RNAオリゴヌクレオチドプローブとして利用するRNA-Pull-Down法が高収率かつ低いバックグラウンドシグナルであるという点で優れていることが確認された。今後はプロテオーム解析へと進め、結合パターンが異なるタンパク質を特定していく。
二つ目は、Csnk1dへのm6A修飾がmRNAの部分構造を変化させ、タンパク質の結合パターンが変化する可能性についての検証実験として、m6A修飾周辺配列の合成RNAオリゴヌクレオチドを用いて1D 1H-NMRを行った（京都大学の片平正人教授の研究室との共同研究）。その結果、m6A修飾は37℃以上の高温条件で維持される部分構造の安定性には影響しない一方、10℃から30℃の低温で形成される部分構造の安定性に比較的大きな影響を与えることが明らかとなった。これにより、m6A修飾を直接認識するタンパク質だけでなく、周辺配列に結合するタンパク質がCsnk1dの発現を制御している可能性が示唆された。
以上の進捗状況から、交付申請書の研究実施計画に記載した「Csnk1d mRNA結合タンパク質の特定実験最適化」と、「Csnk1d mRNAの部分構造にm6A修飾が与える影響の評価」を十分に進めることが出来たため、おおむね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

これまでにm6A修飾酵素であるMettl3を培養細胞でノックダウンする実験においてCsnk1dの翻訳効率が上昇することを確認しているが、Csnk1dのm6A修飾配列を遺伝子編集した培養細胞系列ではまだ確認できていないため、遺伝背景をC57BL/6に揃えたCsnk1dのm6A修飾塩基変異マウスとm6A修飾配列欠損マウスから培養細胞を作成し、Polysome Profiling法により翻訳効率の変化が起こるかを確認する。
また、昨年度までに最適化を進めたRNA-Pull-Down法を更にプロテオーム解析に向けて微調整し、プロテオーム解析を実行する。これにより、m6A修飾の有無により結合パターンが変化するタンパク質を特定する。さらに、特定したタンパク質がm6A修飾を介してCsnk1d遺伝子の発現制御に関与していることを確認するため、そのタンパク質の発現をRNA干渉により減少させ、Csnk1dの発現量の変化を定量解析する実験と、翻訳効率の変化を確認するためのPolysome Profiling法を行う。同時に、体内時計の周期的振動に合わせてリズミックに発現するPeriod2::Luciferase融合タンパク質の発光リズムを測定する実験を行い、RNA-Pull-Down法により特定したタンパク質が体内時計に対して与える影響を評価する。
遺伝子欠損による胎生致死を免れるため、生まれた後にタモキシフェンにより遺伝子欠損を誘導可能なMettl3 flox/flox Ubc-Creマウスを作成したが、タモキシフェンの投与により1週間から2週間で死んでしまうことが明らかとなった。そのため、本研究ではCsnk1dのm6A修飾塩基変異マウスとm6A修飾配列欠損マウスを用いて今後の研究を進める。
また、上記の研究により得られた成果を基本に論文を執筆する。