フタル酸エステルの母体暴露が世代を越えて精子形成異常を引き起こすエピ変異の解明

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18J40019
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 丹藤 由希子 東北大学, 加齢医学研究所, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Keywords: DEHP / DNAメチル化 / 精子形成

Outline of Annual Research Achievements

プラスチックの可塑剤として社会生活の中で広範囲に用いられているジエチルヘキシルフタル酸（DEHP）を妊娠マウスに暴露すると、F1からF3の雄で精子や精細管の異常および精原細胞の機能異常が認められ、それがDNAメチル化変化によるものと考えられている。しかし、そのメカニズムは明らかになっていない。そこで本研究は、DEHPが世代を越えて精子形成に異常を及ぼすエピゲノム変異を同定することを目的としている。
昨年度までに、行ったDEHP暴露後のF1オス生殖細胞の解析から、DEHPによって生じたエピ変異の候補遺伝子を絞り込んだ。しかし、個体間におけるDNAメチル化や遺伝子発現変化のデータのバラつきが大きかった。
そこで今年度は初めに細胞の回収方法の検討を行い、より厳密な細胞分取法を確立した。この方法でF1オスの生殖細胞を回収して再度メチロームとトランスクリプトーム解析を行った結果、生殖細胞形成に関わる11遺伝子について、プロモーター領域のメチル化率の増加と遺伝子発現の低下を認めた。この結果を別な個体の生殖細胞サンプルを用いた定量PCRで確認したところ、5遺伝子について遺伝子発現低下の傾向を認めた。そこで、これら5遺伝子をエピ変異候補遺伝子とした。
次に、プロモーターのメチル化が遺伝子発現を制御することを検証するために、メチル化ルシフェラーゼアッセイを行った。5遺伝子のプロモーター領域をHEK293細胞に発現させてルシフェラーゼ活性を測定した結果、5遺伝子全てにおいてメチル化時のルシフェラーゼ活性の有意な低下を認めた。よって、これらの遺伝子がメチル化により発現制御されることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していたDEHP暴露マウスモデルの確立、DEHP暴露直後の胎仔精巣におけるメチロームとトランスクリプトーム、暴露後のF1精巣における生後200日目のメ
チロームとトランスクリプトームを実施し、メチル化と発現変化の共通した遺伝子を抽出するところまで達成したため。

Strategy for Future Research Activity

当初予定していたF2の解析は実施できていないが、代わりに次年度に予定していたメチル化ルシフェラーゼアッセイを実施し、同定した遺伝子の発現がメチル化の制御を受けることを示すことができたため。