2018 Fiscal Year Annual Research Report
Functioinal analysis of the factors involved in transportation rice glutelin from ER in rice endosperm and utilization of breeding
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18J40102
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
串間(福田) 真子 九州大学, 農学研究院, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | イネ / 貯蔵タンパク質 / グルテリン前駆体 / グロブリン / プロラミン / 変異体 / GOT1B / 小胞輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コメにはデンプンのみならず，約７～８％の貯蔵タンパク質が含まれている．コメ貯蔵タンパク質、グルテリンは小胞体で前駆体型として合成され、ゴルジ体を経由し、液胞へと輸送される。液胞内で前駆体は2つに開裂し、成熟型グルテリンとして蓄積される。
本研究の目的は、グルテリンの合成・輸送に関わる因子の同定及びその因子の機能を明らかにすることである。
申請者らはグルテリン前駆体の細胞内輸送に関わる因子、Golgi transport 1 (GOT1B)を明らかにしたが、その機能の詳細については未解明であった。GOT1Bの存在部位を調べたところ、GOT1Bは小胞体膜に存在していたことから、GOT1Bはグルテリン前駆体及びグロブリンの小胞体からの輸送に関与していることが示唆された。
グルテリン前駆体を高蓄積する変異体、Glup1,Glup5,glup7変異の原因となる因子は未解明である。これら３変異の原因となる因子の機能を推定するために、３変異体の貯蔵タンパク質の局在を蛍光及び電子顕微鏡解析により調査した。その結果、Glup1及びglup7変異体種子において、グルテリン、グロブリン、プロラミンを集積するタンパク質顆粒が小胞体内に存在していた。got1b変異体と同様の蓄積形態を示したことから、Glup1及びglup7変異は、got1b変異と同様にグルテリンの小胞体からの輸送に関わる因子の変異であると示唆された。
また、Glup5変異体種子において、グルテリン及びグロブリンは細胞外に存在し、Paramural body(PMB)を形成していた。glup4/rab5a及びglup6/gef変異体においても、同様にPMBが存在したことから、Glup5変異はglup4/rab5a及びglup6/gef変異と同様に、グルテリン及びグロブリンのゴルジ体から液胞への輸送に関わる因子の変異であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
野生型におけるGOT1Bの細胞内局在をSDG－Western blotにより調べた結果、GOT1BはCis-ER、PB-ER、ゴルジ体に局在することが示唆された。更に、GOT1Bの局在を免疫電子顕微鏡解析により調査した結果、GOT1BはCis-ER、PB-ER、細胞膜、デンスベジクル、液胞に局在が認められた。しかし、ゴルジ体膜にはその局在が認められなかった。両実験結果は一致しなかったものの、GOT1Bは小胞体膜（Cis-ER、PB-ER）に局在し、Cis-ERからのグルテリン前駆体及びPB-ERからのグロブリンの輸送に関与していることが考えられた。一方、GOT1Bがゴルジ体膜に局在するか否かは未解明のままであり、再度検討する必要がある。
グルテリン前駆体を高蓄積する３変異体（Glup1,Glup5及びglup7）種子における貯蔵タンパク質の蓄積形態を調査した。その結果、Glup1及びglup7変異体において、グルテリンとグロブリン、プロラミンが集積する変異PBが小胞体内に認められた。glup2/got1b変異においても同変異PBが存在した(Fukuda et al., 2016)。従って、Glup1及びglup7変異はglup2変異と同様にグルテリン前駆体の小胞体からの輸送に関わる因子の変異であることが示唆された。
Glup5変異体において、グルテリン及びグロブリンを蓄積するParamural body (PMB)が認められた。glup4及びglup6変異体においても、PMBが存在していた(Fukuda et al., 2011, 2013）。従って、Glup5変異はglup4及びglup6変異と同様にゴルジ体から液胞への輸送に関わる因子の変異であると考えられる。
上記の結果は、遺伝子間相互作用解析の結果と対応しており、期待していた通りの結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
イネ種子胚乳細胞内における、GOT1Bの機能を明らかにするために、まず同因子の局在解析を行う。前年度に行ったSDG-western blot解析の結果、GOT1Bは小胞体（Cis-ER及びPB-ER）膜及びゴルジ体膜に存在することが示唆された。そこで、GOT1B抗体を用いて、野生型の登熟種子の電子顕微鏡解析を行い、GOT1Bがゴルジ体膜に存在するか否かを再度検討する。
小胞体からゴルジ体への物質輸送にはCOPII小胞が関与している。近年、COPII小胞形成に関与するSar1がイネ種子胚乳細胞において、グルテリン前駆体の小胞体からの輸送に関与することを明らかにした(Tian et al. 2013, J. of Experimental Botany, 64)。
しかし、イネ種子胚乳細胞内において、そのCOPII小胞を電子顕微鏡で捕らえたことが未だかつて無い。そこで、電子顕微鏡解析により、COPII小胞の特定を試みる。そのために、高圧急速凍結固定法を用いてイネ種子を包埋し、解析する予定である。更に、種子の連続切片を作成し、COPII小胞の３D画像の構築も試みる。
小胞体から出芽するCOPII小胞をイネ胚乳細胞内で見出す事ができたなら、そのCOPII小胞の膜にGOT1Bが局在していることを、免疫電子顕微鏡解析により明らかにする予定である。
現在、glup7変異遺伝子を同定するために、次世代シークエンスによる解析が進行中である。GLUP7遺伝子が同定されたなら、glup7の同座変異体をTilling法により選抜し、同座変異体における貯蔵タンパク質の蓄積形態を調べ、グルテリン、グロブリン、プロラミンの小胞体内での異常蓄積がglup7変異に因ることを明らかにする。
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[Journal Article] Selective sets of mRNAs localize to extracellular paramural bodies in a rice glup6 mutant2018
Author(s)
Yang Y, Chou HL, Crofts AJ, Zhang L, Tian L, Washida H, Fukuda M, Kumamaru T, Oviedo OJ, Starkenburg SR, Okita TW.
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Journal Title
Journal of Experimental Botany
Volume: 69
Pages: 5045-5058
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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