2019 Fiscal Year Annual Research Report
Suppression of tumor metastasis based on the vascular homeostasis regulated by AM-RAMP2 system
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18J40224
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
田中 愛 信州大学, 医学系研究科, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | アドレノメデュリン / 血管恒常性 / 転移前土壌 / エクソソーム / リンパ節転移 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アドレノメデュリン(AM)と、AMの受容体活性調節タンパクRAMP2の血管恒常性維持機構を解明し、癌転移抑制法に展開するため、誘導型血管内皮細胞特異的 RAMP2 欠損マウス (DI-E-RAMP2-/-)を樹立し、検討を行った。本年度は、癌転移実験において、DI-E-RAMP2-/-では、原発巣のサイズがControl群よりも小さいにも関わらず、転移予定先臓器やリンパ節への転移が亢進していることを見出した。DI-E-RAMP2-/-では、リンパ節内に存在する高内皮細静脈(HEV)に構造異常を認め、リンパ節内に流入するリンパ球の局在や細胞数に変化を生じていた。一方、もう一つの受容体活性調節タンパクであるRAMP3のノックアウトマウス(RAMP3-/-)では、Control群と比較して転移が有意に低下する結果が得られた。RAMP2は癌転移に抑制的に働き、RAMP3は癌転移に促進的に働くという逆の結果を得たことから、現在その詳細なメカニズムの検討を進めている。
さらにDI-E-RAMP2-/-において、血管内皮細胞の形態異常と共に、細胞表面のマイクロベジクルの存在を見出し、癌転移に重要な役割を担っていると考えた。ControlとDI-E-RAMP2-/-マウスから血管内皮細胞の初代培養を行い、TNF-αで刺激した後、培養液中に放出されるマイクロベジクルを回収した。腫瘍細胞への添加実験を行うと、DI-E-RAMP2-/-由来のマイクロベジクルで刺激した腫瘍細胞は形が伸長し、細胞増殖が亢進する結果が得られた。マイクロベジクルからRNAを回収し、現在マイクロアレイによるmicroRNAの詳細な検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
計画に従い、血管内皮細胞特異的 RAMP2 欠損マウス (DI-E-RAMP2-/-)の解析を進め、AM-RAMP2系の転移抑制のメカニズムに迫ることができた。DI-E-RAMP2-/-の血管内皮細胞由来のマイクロベジクルが、腫瘍細胞の形質変化や転移を促進させる可能性も見出した。さらに本年度の研究では、リンパ行性転移におけるAM-RAMP2系の意義についても検討を行った。当初はB16BL6メラノーマ細胞を用いて検討したが、リンパ節転移をおこすまでに時間がかかり、評価が難しかったため、ルイス肺癌細胞(LLC)を入手し、マウスの足底部に移植することで、膝窩リンパ節転移を評価する新規転移モデルを導入した。その結果、DI-E-RAMP2-/-では原発巣のサイズがControlよりも小さいにも関わらず、膝窩リンパ節重量が有意に増大しており、早期の段階から転移が生じていると考えられた。そこで、リンパ節転移モデルにおけるリンパ節内の変化についてさらなる検討を進めた。DI-E-RAMP2-/-ではリンパ節内のT細胞数がControlに比べて有意に減少していることが明らかとなった。一方で、T細胞領域周辺に存在するはずの樹状細胞が濾胞周辺に多く存在するという局在の変化が認められた。そこで癌細胞遊走因子であるS100A8/A9についての検討を行った。DI-E-RAMP2-/-ではS100A8/A9ともにControlと比較しても有意な差は認められなかった。DI-E-RAMP2-/-のリンパ節転移にはリンパ球誘導に関与するケモカインや接着因子の方が重要であることが示唆された。一方で、RAMP3-/-ではS100A8/A9ともに有意に発現が低下しており、これらの発現低下が転移前土壌形成を抑制し、癌転移を抑制した可能性が考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1,DI-E-RAMP2-/-では、リンパ節転移が亢進する結果が得られた。癌細胞の転移促進に関わる因子を網羅的に解析する。RAMP2欠損誘導後に転移先となる肺を摘出し、経時的なマイクロアレイ解析を行う。内皮間葉転換誘導因子や腫瘍遊走因子、転移前土壌形成促進因子の探索を行い、癌転移抑制のための新たな治療戦略の足掛かりとする。さらに新たに樹立したリンパ節転移モデルにおいても、遺伝子発現をタイムコースで検討し、リンパ節転移前土壌形成に関わる因子の同定を試みる。
2,血管内皮細胞と癌細胞の相互作用の検討
DI-E-RAMP2-/-の内皮細胞では細胞表面に多数のマイクロベジクルの形成が認められた。マウスより血管内皮細胞を初代培養し、炎症性サイトカインなどを用いて刺激を行い、内皮細胞に生じる変化を観察する。また、内皮細胞より放出されるマイクロベジクルを回収し、マイクロアレイにより内皮細胞の形態維持に関わるmicroRNAを検討する。さらに、癌細胞に対してマイクロベジクルで刺激を行い、形態変化や遊走、増殖の評価を行い、癌細胞と内皮細胞間の相互作用の検討を行う。
3,AM-RAMP2系が腫瘍微小環境に与える影響の検討
DI-E-RAMP2-/-では、腫瘍血管壁において間葉系マーカー陽性細胞が多数観察され、内皮間葉転換(EndMT)が引き起こされていると考えられた。腫瘍微小環境が大きく変化し、腫瘍細胞を悪性化するような因子が産生されていると考えられる。そこで腫瘍微小環境に存在する癌関連線維芽細胞(CAF)に着目し、コントロールマウス、 DI-E-RAMP2-/-それぞれのCAFの単離培養を行い、マイクロアレイを用いて網羅的な解析を行う。
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