Anti-allergic activity of Japanese knotweed known as itredori (Fallopia japonica)

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K02205
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 柏木 丈拡 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 准教授 (60363256)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 島村 智子 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 准教授 (50350179)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ヒアルロニダーゼ阻害活性 / 脱穎粒抑制活性

Outline of Annual Research Achievements

当研究室では、イタドリ葉部のMeOH抽出物がマスト細胞からの脱願粒を強く抑制することを見出した。また、脱穎粒抑制活性と正の相関があるヒアルロニダーゼ阻害活性を測定したところ、高い活性が認められた。本研究では、ヒアルロニダーゼ阻害活性を指標に、高い抗アレルギー活性を示したイタドリの葉に含まれる抗アレルギー活性成分の解明を試みた。
イタドリ葉の抗アレルギー活性を評価するために、イタドリ葉80% MeOH抽出物50 mg eq./mLのヒアルロニダーゼ阻害活性を測定したところ、阻害率98.5%を示し、IC50は8.13 mg eq./mLであった。イタドリ葉80% MeOH抽出物を液液分配により、ヘキサン層、酢酸エチル層、クロロホルム層、BtOH層、水層に分画した。水層は沈殿が生じたため、遠心分離により、水層上清と水層沈殿に分画した。各画分の活性を測定したところ、ヘキサン層66.9%、酢酸エチル層6.22%、クロロホルム層1.38%、BtOH層27.8%、水層上清92.6%、水層沈殿97.2%の阻害率を示した。
ヘキサン層をシリカゲル中圧カラムにアプライし、100%へキサン画分、100%酢酸エチル画分、100% MeOH画分に分画し、活性を測定したところ、100% MeOH画分に高い活性が認められた。ヘキサン層100% MeOH画分をODSオープンカラムで40%、60%、80%、100% MeOH画分に分画し、活性を測定したところ、40% MeOH画分に高い活性が認められたことから、この画分をHPLCに供した。得られたクロマトグラムの保持時間に従い、Fr. A～Dに分画し、活性を測定したところ、ブロードなピークを示したFr. Dに高い活性が認められた。Fr. Dの活性には高分子が関与している可能性があると考えられるが、活性成分の解明にはさらなる分画と分析が必要であると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

科研費を申請した後に、交通事故により半年間入院・休職してしまったため、研究が停滞してしまった。しかしながら、研究分担者である島村淳教授に助けもあり、順調に活性成分の追及が進んでいる。
一方、動物細胞に関する実験は、細胞の培養条件の確立が進んでおらず、予備実験を行うにとどまっているためにさらなる検討が必要である。

Strategy for Future Research Activity

高いヒアルロニダーゼ阻害活性が認められた水層上清、水層沈殿の分画を進めていき活性成分を明らかにする。具体的には、水層上清について逆相計のODS中圧カラムクロマトグラフィーを用い移動相の極性を下げながら溶出させ、各溶出部のヒアルロニダーゼ阻害活性を測定する。強い活性が認められた溶出部に対し、さらに高速液体クロマトグラフィ（HPLC）によりさらに詳細な分画を行い活性成分が含まれるピークを特定する。活性成分を特定した後、その化合物を構造解析に必要な量、単離・精製していく。その際に大量分取用のHPLCカラムや、リサイクル式HPLCによる詳細な分画を行い、活性成分の単離・精製を目指す。単離された活性成分の構造解析を行う。赤外吸収、紫外吸収、質量分析、核磁気共鳴等の各種スペクトルを測定することにより構造の決定を試みる。必要に応じ、合成的手法を用いて推定構造の確認を行う。

同様に、水層の沈殿部についても活性成分の追及を行なう。この画分は水溶性の低い高分子化合物が含まれると予想されるため、限外ろ過やゲルろ過クロマトグラフィーなど分子量の差違による分画方法を試みる。また必要に応じて、高分子化合物を有機化学的手法により単量体に分解しその構造を明らかにする予定である。

Causes of Carryover

事故のため研究が停滞していたことと、培養細胞の培養系が確立できなかったことから、次年度により詳細な条件等を行ない研究推進させるために2年度使用額を設定した。