2019 Fiscal Year Research-status Report
給配水過程における病原細菌リスク増大に対する自由生活性アメーバの寄与とその制御
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18K04411
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| Research Institution | Azabu University |
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Principal Investigator |
大河内 由美子 麻布大学, 生命・環境科学部, 准教授 (00391079)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | レジオネラ属菌 / 自由生活性アメーバ / 給水システム / 精密膜ろ過 / 自家蛍光物質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度は，水道水中の自由生活性アメーバ(FLA)の物理除去がLegionella属菌の生残に及ぼす影響を評価するため，給水栓水を用いて①未処理試料，②3 umフィルターろ過試料を調製し，前培養したLegionella pneumophila (臨床株)およびL. feeleii SG1（環境株）の添加実験を行った。12日間静置し，レジオネラ菌数の経時変化を培養法により調べた結果，ろ過試料中では12日後にいずれのレジオネラ株もその濃度が1%未満に減少したのに対して，未処理試料中では最大で50%のレジオネラが生残した。この結果は，FLAの物理除去がレジオネラ生残性を大きく低下させることを示す。
一方，給水システム内のFLA情報を集積するため，給水栓から分離した71株を対象として，属特異的プライマー対を用いた推定を行った。検出対象としたFLAは海外の水道システムで検出事例の多いAcanthoamoeba属，Naegleria属，Vermamoeba vermiformisの3種である。同時に，代表的なアメーバ抵抗性細菌(ARB)であるLegionella属とMycobacterrium属の検出も試みた。71株中，38株が3種のアメーバ属のいずれかのプライマー対でPCR増幅が確認され，28株がV. vermiformisであった。ARBであるLegionella属， Mycobacterrium属はともに不検出であった。
また，培養を介さないFLA検出法を開発するため，自家蛍光物質を指標としたFLAの定量を試みた。給水栓試料から分離培養したV. vermiformisの細胞数を計数後，PYG培地またはPSAバッファーを用いて希釈列を作成した。蛍光プレートリーダーで測定したところ，バッファー希釈試料において2種の生体分子を指標とした栄養型細胞の定量検出が可能であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初，給水栓水からの自由生活性アメーバの分離培養に難航した。最終的には自由生活性アメーバの安定した分離培養が可能になったが，アメーバ細胞に寄生するアメーバ抵抗性細菌については十分な検討を行う時間がとれなかった。また，自家蛍光物質を指標とした自由生活性アメーバの測定法の開発においては，栄養型FLAを用いた場合には定量的検出が可能であることを確認したが，シスト化させるのに想定外の時間を要したため，水道システム内の自由生活性アメーバの大部分を占めると予想されるシスト型細胞に関する検討が未着手である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，レジオネラ臨床株と環境株の2種を用いた添加実験により，水道水中の自由生活性アメーバ(FLA)の精密ろ過膜処理による物理除去がLegionella属菌の生残に及ぼす影響評価を引き続き行う。また，レジオネラを添加しない場合のろ過試料／未処理試料中で再増殖する細菌種の調査とFLA数の変化を調べ，ＦＬＡの物理除去が病原細菌の再増殖に及ぼす効果を明らかにする。なお，2019年度に実施したFLAの分離培養と属推定が，冬季に採水した試料に偏っているため，夏季の給水栓試料からのFLA分離培養と属推定についても実施する予定である。
さらに，培養を介さないFLA検出法の開発に向けて，Vermamoeba vermiformis以外のFLA分離株を用いて自家蛍光物質を指標とした定量検出を試みるとともに，シスト化細胞を調製し，シスト化した細胞の検出可能性を評価する。また，水道水試料に添加した場合の定量阻害の有無を評価する。得られた結果に基づき，水道水試料からのFLA定量検出に求められる前処理方法（濃縮倍率，濃縮法，夾雑物による妨害除去の必要性等）について考察を加える予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大を受けて年度末に実施予定であった実験が計画通り実施できなくなったため，2020年度に改めて必要試薬の購入に充当する予定である。
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