Development of next generation single cell analysis ttechnology for monitoring the live bacterial cells in environment microorganisms.

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K04414
• Research Institution: Nagaoka National College of Technology
• Principal Investigator: 川上 周司 長岡工業高等専門学校, 環境都市工学科, 准教授 (00610461)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: シングルセル / アプタマー / cell-SELEX

Outline of Annual Research Achievements

微生物をシングルセルレベルかつ系統分類学に基づく種類の同定を伴って検出する技術にFISH法がある。これまで環境微生物がくの分野で幅広く用いられているが、FISH法の最大のデメリットとして、生菌状態では適用できないことが挙げられる。蛍光標識DNAプローブを菌体内に浸透させるための細胞固定の操作により微生物は死滅しており、例えば同定後に標的の微生物だけを分取して培養するといった方法はアイディアとしてはあっても実現できずにいる。本研究では、このFISH法の最大の課題を解決するためにアプタマーを用いたシングルセル検出技術を確立することを目的としている。アプタマーは一本鎖核酸からなり、自らが結合して高次構造を形成することで抗体のような働きを持った分子である。このアプタマーが微生物の細胞表面に結合することで微生物を生菌状態でラベルすることが可能になる。これまでアプタマーを作成するにはCell-SELEX法と呼ばれる手法での合成が主であった。しかし、この手法では標的微生物細胞を大量に準備する必要があり、未培養の微生物には適用することが難しかった。本研究では未培養の微生物にも適用可能なcell-SELEX法のプロトコルを構築することを目指している。
今年度は、極めて少量の微生物細胞からDNAを抽出するステップの最適化を行った。結果、10^2cell/mLの細胞懸濁液からのDNA抽出に成功した。次に標的微生物と非標的微生物を混合した模擬サンプルに対し、ランダム配列のアプタマーを結合させたのち、10^2cell/mLまで段階希釈を行ったサンプルに対してアプタマーの配列の決定を行った。結果、非標的からの若干のノイズはあったものの、標的微生物に結合したアプタマーの配列を手に入れることができた。この方法を環境サンプルに適用させることで、未培養の微生物を検出できるアプタマーの取得も可能になると思われる。