2018 Fiscal Year Research-status Report
Reversible utilization of enzyme by grafting and refolding
| Project/Area Number |
18K04821
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
|---|
Principal Investigator |
大橋 秀伯 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 特任准教授 (00541179)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 固定化酵素 / タンパク質 / リフォールディング / 大気圧プラズマ / グラフト重合 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
従来の固定化酵素は一旦失活してしまうと、その機能を回復させることは困難である。一方、酵素自体はタンパク質であり、可溶化剤によってポリペプチドの一次構造までほどくと、その後可溶化剤を取り除くことで、本来の三次元構造と機能を回復することが可能である（リフォールディング）。一方で材料表面に片末端を固定化したグラフト鎖は可逆的な振舞いを示す。そこで、酵素をグラフト鎖として材料表面に固定化することで、可逆性を付与し、酵素が失活してその正しい三次元構造と機能を失っても、可溶化剤の添加／除去によって三次元構造を回復させることで、何度でも機能を回復させることのできる固定化酵素を実現する。
酵素（タンパク質）を末端で材料表面に繋がれたグラフト鎖とするためには、タンパク質側と材料表面側をそれぞれ修飾する必要がある。本研究においては、末端の「仮固定」の後に「本固定」を行うという段階を踏むことにより、確実に末端でグラフトする戦略を立てた。当該年度においては、モデルタンパク質として、緑色蛍光タンパク質（GFP）を選択し、遺伝子組み換えによりそのC末端に仮固定／本固定用のペプチドとしてHistidineタグ及びcysteineを導入した。一方で、材料表面側の修飾として、ポリエチレン多孔質膜基材の表面に大気圧プラズマグラフト重合法により、エポキシ基を有するglycidyl methacrylate（GMA）を固定化し、それを足掛かりとして仮固定用の官能基Ni-iminodiacetic acid（Ni-IDA）基を導入した。これにより、GFPを材料表面に仮固定することに成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当該年度においては、本筋である酵素グラフト手法に向けた酵素末端・材料表面修飾の方も非常に順調に進んでいる上、材料表面の効率的な修飾のために、大気圧プラズマグラフト重合法の開発を並行して行った。この結果、本研究で用いるGMAのみならず、他の様々な機能性ポリマー（正電荷・負電荷を持つポリマーや生体適合ポリマー等々）を簡便に材料表面に固定する手法を開発することに成功した。この結果も含め、当初想定していたよりも大きく研究が進展したと言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在までに、タンパク質（GFP）側には仮固定／本固定用の官能基を、材料表面側には仮固定用の官能基を修飾することに成功した。今後の推進方策として、まず、材料表面に本固定用の官能基を固定する手法を開発する。前述のエポキシ基もしくは代わりとなる活性官能基を足掛かりに、C=C二重結合を持つ官能基（maleimideやstyrene等）を固定化する。これにより仮固定／本固定用の官能基の双方が材料表面に固定化されることとなる。この機能化材料表面に、前年度に作製した仮固定／本固定用のペプチドを有するGFPをグラフト固定化する。histidineタグ－Ni-IDAにて仮固定した後、cysteineのSH基とC=C基のクリック反応により本固定を行う。その後、可溶化剤の添加／除去によるグラフトGFPの繰り返し活性回復を蛍光を用いて観察、確認する。このコンセプトが証明された後、多様なタンパク質に本手法を応用することで、多様なタンパク質の繰り返し活性回復を行い、さらには酵素反応プロセス中へのグラフト酵素の導入を図る。
|
| Causes of Carryover |
自己負担の研究費により本テーマの研究遂行が可能であったため、次年度使用額が生じた。生じた残額に関しては、来年度以降に遂行していく予定としている。特に、本筋である再生可能な固定化酵素の開発に加え、前年度に研究が大きく進展した大気圧プラズマグラフト重合法に関しても予算を振り分け、常圧・常温でのグラフト重合を可能にするなど、更なる利便性の向上に関しての検討も進めていく。
|
