2019 Fiscal Year Research-status Report
グラム陽性細菌の自己誘導ペプチドを捕捉するクオラムセンシング阻害技術の開発
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18K04844
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
加藤 紀弘 宇都宮大学, 工学部, 教授 (00261818)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奈須野 恵理 宇都宮大学, 工学部, 助教 (80709329)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | クオラムセンシング / 細胞間情報伝達機構 / 自己誘導ペプチド / 高分子ミクロスフェア / 水晶振動子マイクロバランス法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グラム陽性細菌のクオラムセンシングでは、細菌固有の一次構造を有するペプチドが情報伝達シグナルとして利用される。細胞外部へ放出された情報伝達ペプチドは膜受容体に結合し、標的遺伝子の発現が活性化される。本研究では、情報伝達ペプチドと高い親和性を有する高分子をスクリーニングし、細胞外部で情報伝達ペプチドを高分子ミクロスフェアへ捕捉するクオラムセンシング阻害技術を検討した。
コレステリル化ポリビニルアルコール(PVA)が水溶液中で自己形成するミクロスフェアを、分子量、けん化度の異なるPVAから調製しその粒径分布を動的光散乱法で評価した。黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusの培養液との混合により、クオラムセンシングにより誘導されるヘモリジンの捕捉効果をヒツジ赤血球の溶血活性試験により評価した。更に、培養中で情報伝達ペプチドを捕捉するクオラムセンシング阻害効果をヘモリジン生産量から評価した。これらの結果、調製した疎水化PVA粒子には、ヘモリジンを捕捉する溶血阻害効果、情報伝達ペプチドAIP-I及びAIP-IIの捕捉に起因するヘモリジン生産抑制効果があることを示した。疎水化PVA粒子と情報伝達ペプチドの親和性は、水晶振動子マイクロバランス法 (QCM法)のアドミッタンス解析法により評価した。
う蝕原因菌であるStreptococcus mutansには18残基のペプチド18CSPによりバクテリオシン生産が誘導されるクオラムセンシング機構が存在する。そこで疎水化PVA粒子と18CSPとの親和性をQCMアドミッタンス解析により試験し効果的な捕捉能を有する粒子の調製条件を明らかにした。
コレステリル基を導入した疎水化PVAが水溶液中で自発的に形成するミクロスフェアは、グラム陽性細菌のクオラムセンシングシグナルとなる環状ペプチドおよび直鎖ペプチドを効果的に捕捉可能である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
クオラムセンシングにより毒性物質生産が誘導される黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusの環状Autoinducing peptideであるAIP-Iを、う蝕原因菌であるStreptococcus mutansの直鎖Competence stimulating peptideである18CSP（SGSLSTFFRLFNRSFTQA）を本研究では試験した。これらの情報伝達シグナルを培養液から効果的に除去しクオラムセンシングを阻害する捕捉粒子として、コレステリル化ポリビニルアルコール(PVA)を分子量とけん化度の異なるPVAから有機合成し、コレステリル基導入量を酵素法により決定した。この疎水化PVAが水溶液中で形成するミクロスフェアの粒子径は動的光散乱法により決定した。情報伝達シグナルと疎水化PVA粒子との親和性を評価するために、水晶振動子マイクロバランス法(QCM法)の修飾金電極を作製し、コンダクタンスの周波数依存性を測定し吸着量を定量する解析法を確立した。水晶振動子表面の金電極に非特異吸着の少ないポリエチレングリコール鎖を導入した自己組織化膜を作製し、そのカルボキシ基末端を水溶性カルボジイミドを用いて活性化エステルとした後にAvidinを固定化した。あらかじめN末端をビオチン修飾したBiotin-AIP-IおよびBiotin-18CSPを作製し、分子特異的なBiotin-Avidin結合により情報伝達シグナルを追跡する。各情報伝達シグナルを水溶液中で疎水化PVA粒子と混合し粒子に捕捉させる。溶液中に未反応で残存する情報伝達シグナルをQCM法で定量可能とした。8残基の環状ペプチドAIP-Iあるいは18残基の直鎖ぺプチド18CSPは、それぞれ疎水化PVA粒子に捕捉され、溶液中にフリーで存在するクオラムセンシングシグナルを低濃度に維持可能であることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
クオラムセンシングの活性化に伴うStaphylococcus aureusの病原性因子の発現は、ヘモリジンによるヒツジ赤血球の溶血活性試験により追跡可能とした。そこで次に、QCM法で疎水化PVA粒子により情報伝達シグナルの捕捉効果を示したStreptococcus mutansにおいてcom系クオラムセンシングにより発現するバクテリオシンに着目し、その生産/抑制挙動を可視化するバイオアッセイ系を確立し、情報伝達シグナルの捕捉法によるクオラムセンシング抑制効果を評価する。バクテリオシンSmbAおよびSmbBを生産するS. mutans GS5株およびその18CSP非生産株を用い、バクテリオシン感受性株を用いた増殖阻害試験を実施する予定とする。
更に、情報伝達シグナルの捕捉効果に優れた材料化を目指し、これまで開発を進めてきたミクロスフェアに加えポリビニルアルコール(PVA)不織布などの材料を試作しその性能を明らかにしていく。疎水化PVA粒子を分散させたPVA紡糸溶液からの電解紡糸、疎水基を導入したPVA多孔性担体などを設計、調製しS. aureusあるいはS. mutansのクオラムセンシング抑制効果をQCM法とバイオアッセイの併用により多角的に試験する予定とする。
最後に本研究課題により明らかとなった知見を総合的にまとめ、短鎖ペプチドを情報伝達シグナルとするクオラムセンシングの阻害素材を設計するのに必要な指針をまとめる。
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| Causes of Carryover |
今年度の研究費の使用は、当初の予定どおり進捗しほぼ予定額どおりであるものの端数に残額が生じた。次年度予算と合算して物品費（消耗品費に充当）として使用し、予定どおりの研究を遂行する予定である。
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