2018 Fiscal Year Research-status Report

Discovery of specific redox systems for bacterial cytochrome P450s

Research Project

Project/Area Number	18K04846
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	平川秀彦筑波大学, 生命環境系, 准教授 (90451799)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	シトクロムP450 / 電子伝達システム / スクリーニング / 自己集合
Outline of Annual Research Achievements	シトクロムP450はパートナーとなる電子伝達タンパク質および還元酵素を介して電子を受け取ることにより触媒活性を発揮する。ただし、基質の結合後でなければ、電子を受けてないことが知られており、基質非存在下ではシトクロムP450と電子伝達タンパク質は結合しないと長らく考えられてきた。古細菌Metallosphaera sedula由来核内増殖抗原ヘテロ三量体を用いることでシトクロムP450、電子伝達タンパク質、還元酵素を人為的かつ安定的に集合させることができる。古細菌Sulfolobus solfataricus由来核内増殖抗原ヘテロ三量体のサブユニットと組み合わせることにより、シトクロムP450、電子伝達タンパク質、還元酵素を人為的に集合させた場合に、反応中はシトクロムP450と電子伝達タンパク質が安定的に相互作用すること、を解析により明らかにした。さらに、複数の電子伝達タンパク質と還元酵素をシトクロムP450に人為的に近接させた実験の解析から、人為的に近接させた場合に電子をシトクロムP450に伝達した後も電子伝達タンパク質はシトクロムP450に結合している、すなわち、基質非存在下においてもシトクロムP450と電子伝達タンパク質は安定的に相互作用することを明らかにした。また、この相互作用は近接した還元酵素によって競合的に阻害されることも解析により明らかにした。本解析結果はBiotechnology Journal誌において発表し、研究イメージが内表紙として採用された。以上の研究成果は、シトクロムP450、電子伝達タンパク質、還元酵素を人為的に集合させることで、シトクロムP450ー電子伝達タンパク質間の相互作用を基質非存在下において検出可能なことを強く示唆している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 所属機関の変更に伴い、遺伝子組換え実験の許可を新たに得るために半年を要したため。
Strategy for Future Research Activity	当初の研究計画通りに、細菌由来シトクロムP450の触媒活性に必要な補助タンパク質を特定する系を構築するために、（１）発現系を構築した上で、（２）電子伝達タンパク質を還元可能な還元酵素を効率的に特定するための、マルチウェルプレートを用いたスクリーニング系を開発する。さらに（３）マルチウェルプレート上で電子伝達タンパク質、還元酵素、シトクロムP450を人為的に近接することで、シトクロムP450と特異的に相互作用する電子伝達タンパク質を特定するシステムを確立する。（４）最終的には、実際にパートナーとなる電子伝達タンパク質および還元酵素が不明なシトクロムP450に対して（３）で確立したシステムを適用し、その実用性を明らかにする。
Causes of Carryover	所属機関の変更に伴い、遺伝子組換え実験の許可を新たに得る必要があり、そのため、実質的な実験の開始が半年ほど遅れたため。