2018 Fiscal Year Research-status Report
TALEの高いDNA配列認識特性を利用した遺伝子変異検査法の開発
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18K04849
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
迫野 昌文 富山大学, 大学院理工学研究部(工学), 准教授 (50391959)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | TALE / BRET / 遺伝子変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TALEの高いDNA配列認識能を利用することで、遺伝子一塩基変異を識別する素子となると考え、一塩基変異が高頻度に生じるKRAS遺伝子をモデルとする検出系の構築を行った。KRAS遺伝子は大腸ガン治療の重要なバイオマーカーである。KRAS遺伝子の一塩基変異を検出するために、蛍光タンパク質YFPVenus(Venus)および発光タンパク質Renilla Luciferase(RLuc)を融合した2種類のTALEを調製し、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)を用いた新たな検出系の作製を行った。Golden Gate法を用いてKRAS遺伝子中の異なる塩基配列に結合する3種類のTALE を作製した。VenusをTALEのC末端に融合したTALE-Venus、RLucをTALEのC末端に融合したTALE-RLucをそれぞれ作製した。作製した融合タンパク質の発光特性および蛍光特性を検討した。rLucは、融合に伴う発光強度の低下とKcat値の低下がみられたが、BRETに充分な発光ドナー特性を示した。また、蛍光タンパク質は融合化による蛍光特性の損失が見られなかった。ターゲット遺伝子存在下において、調製した融合タンパク質をそれぞれ添加した後、発光基質を添加し発光特性を調べた。その結果、ターゲット配列を有する遺伝子において、明らかな蛍光が観測された。一方、一塩基異なる非ターゲット遺伝子においては、特異的な発光は観測されなかった。したがって、三者複合体形成条件において明らかなBRETを生じていることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定の複合タンパク質の合成に成功し、発光特性の損失もほとんどなかった。DNA、融合タンパク質の三者複合体の形成が確認され、BRETによると思われる特異蛍光も観測された。
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| Strategy for Future Research Activity |
特異蛍光のS/N向上が必要であり、タンパク質間距離やBRETペアの検討を含めた最適化が必要である
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