2019 Fiscal Year Research-status Report
TALEの高いDNA配列認識特性を利用した遺伝子変異検査法の開発
| Project/Area Number |
18K04849
|
|---|
| Research Institution | University of Toyama |
|---|
Principal Investigator |
迫野 昌文 富山大学, 学術研究部工学系, 准教授 (50391959)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | TALE / BRET / 遺伝子変異 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Transcription Activator-Like Effectorタンパク質(TALE)は、DNA配列中の塩基を特異的に認識することが可能であり、DNA配列依存的に、DNAと複合体を形成することができる。このことから、高度な正確性が要求される遺伝子検査において、TALEは一塩基の違いを見分ける優れたDNA配列認識素子となると予想される。したがって、TALE-DNA複合体形成を検出することで、検査対象DNA中にターゲット配列が存在するかを確認可能となる。
具体的には、標的として一塩基変異が起こることで知られるKRAS遺伝子を用いた。TALEによって一塩基変異を見分けるために蛍光タンパク質YFPVenus、発光タンパク質Renilla Luciferaseを融合したTALEを調製し、一塩基変異が存在する場合のみ生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)が起こる系を作製した。2種類のTALEに目的とするDNAを加えBRETによる発光評価を行った。標的とした変異型(Mutant)の時のみBRETにより蛍光強度が高い値を示し、KRAS配列を持たない時および野生型(Wild type)では強度が著しく減少した。蛍光偏光解消法による解離定数(Kd)の値が変異型では296nM、野生型では>1800nMと推定された。このことからもTALEが変異型にのみ強く結合することが分かる。
次に作製したTALEを利用したTALENの機能および一塩基変異配列への選択的な切断の評価を行った。標的配列であるKRAS (GAT)のときのみ選択的に切断されており、それ以外のKRAS配列では切断がほとんど起こっていない。この結果から作製したTALENは標的配列選択的な切断が可能であることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の中心課題となるTALEによる一塩基変異検出系の作製に成功した。
今後手法の一般性を持たせるためにも他の遺伝子で同様の実験を行う必要がある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
オフターゲット効果を低減したTALENを用いることでゲノム編集を従来よりも正確に行うことが可能になると考えられる。この能力を活かした新たなゲノム編集治療への応用が期待される。
|
