2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of genetic test method utilizing DNA sequence recognition characteristics of TALE.
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18K04849
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
迫野 昌文 富山大学, 学術研究部工学系, 准教授 (50391959)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / TALEN / オフターゲット効果 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は一塩基の違いを正確に見分けられるTALEの構築を目的としている。標的としてDNA配列中に一塩基変異が起こることで知られるKRAS遺伝子を用いた。TALEによって一塩基変異を見分けるために、蛍光タンパク質YFPVenus(Venus)、発光タンパク質Renilla Luciferase(RLuc)をそれぞれTALEに融合し一塩基変異が存在する場合のみ生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)が起こる系を作製した。2種類のTALEおよびDNA存在下におけるBRET発光評価を行った。標的としたKRAS遺伝子の一塩基変異型のみ高い蛍光強度を示し、KRAS配列を持たないDNAおよびKRAS遺伝子の野生型では強度が著しく減少した。蛍光偏光解消法より解離定数(Kd)の値が変異型では296 nM、野生型では>1800 nMと推定され、任意に挿入した一塩基ミスマッチがDNAとの相互作用に大きく影響していることが示唆された。これらの結果から標的配列にあらかじめ一塩基ミスマッチを持たせたTALEはDNA配列中の一塩基変異による一塩基の違いを正確に見分けられることが示唆された。TALENによるDNA切断評価を行った。標的配列であるKRAS (GAT)のときのみ選択的に切断されており、それ以外のKRAS配列では切断がほとんど起こらなかった。この結果から標的配列にあらかじめ一塩基ミスマッチを持たせたTALENはDNA配列中の一塩基の違いを正確に認識した切断が可能であり、オフターゲット効果の低減が示された。
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