2018 Fiscal Year Research-status Report
High throughput technique for measuring specific enzyme activities of a metabolic pathway
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18K04850
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
戸谷 吉博 大阪大学, 情報科学研究科, 准教授 (70582162)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 酵素比活性 / 反応速度論モデル / 大腸菌 / 解糖系 / 代謝工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微生物を利用して様々な有用化合物が生産可能であるが，実用化には生産速度向上のための代謝フラックスの強化が必要であり，代謝経路の律速となっている反応の特定と解消が求められる．酵素比活性 (Vmax) は，その酵素が触媒しうる最大の反応速度を表す情報であり，代謝経路中の律速反応を特定するための重要な手がかりである．しかし、従来のVmaxの測定では、酵素ごとに別々のアッセイ方法が必要となるため，多数の酵素反応について測定することは困難であった．本研究では，一連の代謝経路に含まれる複数酵素のVmaxを同時に測定するための技術の開発を目的とする．細胞から抽出した粗酵素液を用いて試験管内で一連の代謝経路を駆動する．中間代謝物の濃度時系列を計測し，速度論モデルを用いて各酵素反応のVmaxを最適化計算により求める．
本年度は「代謝経路の酵素比活性の一斉測定技術の開発と検証」を行った．まず，既報の大腸菌の反応速度論モデルを用いて，各酵素反応のVmaxに任意の値を設定し，反応の時間発展をシミュレーションすることで，中間代謝物質濃度のタイムコースについての仮想的な実験データを生成した．この仮想的な実験データを用いて，元のVmaxの値を最適化計算により予測できることを実証した．また，精度よくVmaxを予測可能な実験条件について検討した．次に，大腸菌の親株と解糖系の一遺伝子過剰発現株を回分培養し，回収した菌体を破砕することで粗酵素抽出液を得た．試験管内における酵素反応実験では，反応液に必要な基質，補酵素，粗酵素抽出液を加え，反応液を経時的に回収した．中間代謝物濃度のタイムコースを液体クロマトグラフィー・質量分析計を用いて測定し，Vmaxの最適化に向けた検討を行った．
また，当初予定に先駆けて，2年目に計画していた大腸菌のチロシン生産株の構築を実施し，培養液中にチロシンの生産を確認した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究においては，代謝経路の酵素比活性の一斉測定技術を開発し，代謝工学の研究に応用することを目指している．本年度は，反応速度論モデルを構築し，中間代謝物のタイムコースデータから，代謝経路に含まれる酵素のVmaxの値を最適化計算により一斉に推定する基盤システムを構築した．シミュレーションによる仮想的な実験を通して，最適化計算によりVmaxを予測できることを実証することができた．また，実際の大腸菌の細胞由来の粗酵素抽出液を利用した試験管内における酵素反応実験においても，中間代謝物濃度のタイムコースを測定し，検討が進んでいる．さらに，予定を前倒し，チロシン生産株の構築・評価している．これらの状況により順調に研究は進展していると考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，試験管内における酵素反応実験から取得した中間代謝物のタイムコースデータから，各酵素のVmaxをどの程度の精度で予測できているか正確に評価するため，推定したVmaxの信頼区間を計算できるようにする．また，目的物質であるフェノールの生産株を構築するため，本年度構築したチロシン生産株に異種生物から取得したチロシンフェニルリアーゼを異種発現し，フェノール生産株を構築する．目的化合物生産時におけるフラックス分布を13C代謝フラックス解析により求める．本酵素比活性測定技術を用いて代謝経路のVmaxを推定し，中枢代謝経路における律速点を同定する．必要に応じて芳香族アミノ酸の合成経路について，速度論モデルと代謝物の測定対象を拡大する．
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