2019 Fiscal Year Research-status Report
定量プロテオミクスによる代謝制御機構の解明と有用物質生産酵母構築への応用
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18K04851
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松田 史生 大阪大学, 情報科学研究科, 教授 (50462734)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 定量プロテオーム解析 / 出芽酵母 / 代謝制御機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度に行ったワイン酵母株、日本酒酵母株、パン酵母株および実験室酵母株の酵素発現量プロファイル比較によるTCAサイクル制御機構の解析の結果、ワイン酵母ではTCA回路のタンパク質発現量が増加するなどの変動が見られた。そこで本年は、これらの知見を確認するために13C代謝フラックス解析を実施した。出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae の2倍体株（実験室株: BY4947、ワイン株: QA23、パン株: RedStar、清酒酵母: Kyokai7）を合成培地中で培養し、[1-13C]グルコース含有SD培地 (50 ml, 30℃) で回分培養し、対数増殖期の菌体を回収した。培地中のグルコース、グリセロール、酢酸の濃度はHPLCで、エタノールの濃度はGCで分析した。得られた情報から比速度を算出することで細胞内外の物質収支を決定した。菌体のタンパク質由来アミノ酸の13C標識割合をGC-MSで分析し、ソフトウェアmfapyで代謝フラックス分布を算出した。その結果、ワイン酵母株、日本酒酵母株、パン酵母株ではTCAサイクルの代謝フラックスレベルが向上していた。日本酒酵母株、パン酵母株ではグルコース比消費速度、およびエタノール比生産速度の増加が認められた。さらに、ATPの収支を推定したところ、日本酒酵母株、パン酵母株ではATPの消費量が増加しており、エタノール比生産速度の向上に寄与する可能性が示唆された。得られた知見をもとにペントースリン酸経路の酵素反応速度式のパラメーター推定を行ったところ新規な生成物阻害の存在が示唆された。さらに、得られた知見をもとにブタノール等の高生産株の代謝デザインを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
酵素発現量プロファイル比較による解析結果をもとに、13CMFAを組み合わせることで、計画通りATP再生を担う責任酵素と代謝制御機構の推定を行うことができた。酵母代謝速度論をもとに、ペントースリン酸経路の制御にかかわる新たな制御メカニズムを推定した。さらに、ブタノール生産酵母の代謝デザインを行った。以上の結果から、（２）おおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は実用酵母株の定量プロテオーム解析から示唆された代謝制御機構をもとに、さらに酵母代謝速度論モデルの構築を進める。また、代謝制御の責任酵素候補のタンパク質を強発現した実験室酵母株を作成し、ブタノール等の有用物質生産能力の向上を目指す。複数の酵素発現量の向上が必要な場合はグローバルレギュレーター等の活用を試みる。
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