2018 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of the immunostimulatory activity of CpG ODNs by G-quadruplex formation
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18K04858
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| Research Institution | National Institute for Materials Science |
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Principal Investigator |
山崎 智彦 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 機能性材料研究拠点, 主幹研究員 (50419264)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池袋 一典 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 卓越教授 (70251494)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | トール様受容体9 / CpG ODN / Gカルテット構造 / 免疫活性化 / アジュバンド / I型インターフェロン / インターロイキン / NFカッパ B |
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| Outline of Annual Research Achievements |
自然免疫受容体トール様受容体9（TLR9）のリガンド分子である一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)には、パリンドローム配列とポリG配列を持ち複雑な高次構造を形成してナノ粒子化するクラスAと直鎖構造のクラスBの2種類が存在し、両方ともTLR9に結合するにもかかわらず、誘導する因子がそれぞれI型インターフェロンもしくはIL-12/IL-6と異なることが報告されている。本研究では、分子内Gカルテット構造もしくは分子間Gカルテット構造を形成させるようにCpG ODNの配列を設計することで、CpG ODNの4次構造を制御することで免疫活性機能を改変することを目的として研究を進めている。
2018年度はGカルテット構造を有するCpG ODNの設計を進め、2種類のCpG ODNを開発した。開発したCpG ODNについて、円偏光二色性(CD)を用いた2次構造の解析、核酸の電気泳動を用いた分子量の解析、295nmの吸収を指標とした融解曲線解析を行った。その結果、今回開発したCpG ODNは分子内Gカルテット構造を形成することが示された。ヒト胎児の腎由来の細胞株HEK293株を用いて、免疫反応において中心的役割を果たす転写因子であるNFカッパ Bの活性化により免疫活性化能を評価した。TLR9安定発現293細胞においては、開発したCpG ODNは既存のTLR9アゴニストであるODN2006, K3と同様にNFカッパ Bの活性化を誘導した。一方で、TLR9を発現していない293細胞においてはNFカッパ Bの活性化は示されなかった。この結果から、本研究で開発したCpG ODNは分子内Gカルテット構造を形成し、ループ部分に導入したCpG ODNによりTLR9を介して免疫活性化を誘導することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実施計画に従い研究がすすんでおり、おおむね順調に伸展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で開発したCpG ODNについて、免疫細胞であるマウスマクロファージ、ヒトB細胞株、ヒト樹状細胞株、ヒト末梢血単核球細胞を用いて、インターロイキン(IL)-12、IL-6、I型インターフェロン（IFN）であるIFN-アルファ、IFN-ベータの誘導をELISA法、ならびに定量PCR法を用いて解析する。
また、細胞内ならびにTLR9が局在している細胞内小胞のpHとカリウムイオン、ナトリウムイオンを模倣した細胞内環境での開発したCpG ODNのCD構造解析を行い、細胞内においてCpG ODNのGカルテット構造がどのように変化するかを検討する。これらの結果より、CpG ODNのトポロジーと免疫活性化機能との関係について考察を行い、その結果をもとに、遺伝的アルゴリズム法を用いて、より活性が高いCpG ODNの開発を行う。
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| Causes of Carryover |
（次年度使用額が生じた理由）本研究を申請する際に、予備実験を十分に進めてきた。予備実験の際に購入した試薬類の残りを利用して研究を進めたため、初年度の試薬代、消耗品代が当初の予定額から下回った。また、研究業務員を雇用して研究を進める予定であったが適任者が見つからず、研究代表者と北海道大学大学院生命科学院博士後期課程に所属する学生1名で本研究に従事したため、人件費・謝金に残額が生じた。
本研究を進めるに十分な知識と技術を有する人材を見つけ出し、2019年4月から雇用して研究を進めることが確定しており、本年度は加速的に研究を進めることができる。
（使用計画）2019年度分として請求した助成金(1,300千円)と合わせて、人件費として1,500千円、試薬・物品と代として650千円、学会発表のための参加費・旅費として80千円を使用する計画である。
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