2019 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of the immunostimulatory activity of CpG ODNs by G-quadruplex formation
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18K04858
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| Research Institution | National Institute for Materials Science |
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Principal Investigator |
山崎 智彦 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 機能性材料研究拠点, 主幹研究員 (50419264)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池袋 一典 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 卓越教授 (70251494)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | トール様受容体9 / CpG ODN / Gカルテット構造 / 免疫活性化 / アジュバント / I型インターフェロン / インターロイキン / ワクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
自然免疫受容体トール様受容体9（TLR9）のリガンド分子である一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)には、パリンドローム配列とポリG配列を持ち複雑な高次構造を形成してナノ粒子化するクラスAと直鎖構造のクラスBの2種類が存在し、両方ともTLR9に結合するにもかかわらず、誘導する因子がそれぞれI型インターフェロンもしくはIL-12/IL-6と異なることが報告されている。本研究では、分子内Gカルテット構造もしくは分子間Gカルテット構造を形成させるようにCpG ODNの配列を設計することで、CpG ODNに立体構造を形成させ、免疫活性機能を改変することを目的として研究を進めている。
2019年度は昨年度に設計したGカルテット構造を有するCpG ODNについて、構造と免疫活性化能のについて詳細な解析を行った。UVスペクトル解析、電気泳動解析、円偏光二色性（CD）解析を行った結果、我々の開発したＧカルテット構造を有するCpG ODNは単量体であり、かつハイブリット構造（グアニン四重鎖構造で、ヌクレオチド主鎖の配向が3:1）を取ることが分かった。またＧカルテット構造の形成によりDNA分解酵素に耐性を獲得することが示された。また、2番目のループ領域に挿入する塩基の長さとCpGモチーフの数を改変することで、トポロジーは変化しないが免疫活性化能は変化することが示さた。マウスTLR9を用いた免疫沈降実験により、TLR9との結合能が構造により変化し、その結果として免疫活性化能に影響することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験計画に沿って研究が進んでおり、順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ｇカルテット構造を有するCpG ODNとTLR9との結合の詳細を解析するために、表面プラズモン共鳴(SPR)をもちいてCpG ODNとTLR9との相互作用を解析する。
また、免疫細胞を用いて免疫活性化能を示したＧカルテット構造を有するCpG ODNについて、マウスを用いてアジュバント能力を検証する。モデル抗原としてオブアルブミンを用いてＧカルテット構造を有するCpG ODNと一緒にマウスに皮下投与し、マウス血液中のオブアルブミン特異的IgG1, IgG2c, IgE抗体の量をELISA法により定量する。またマウス脾臓細胞を調製し、オブアルブミン添加によるIL-13, IFN-γの量を定量することにより、ナイーブCD4+ T細胞の分化能を評価する。
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| Causes of Carryover |
2019年度から2020年度の2年間で実施の予定であった、CpG ODNの構造と物性解析においては、2019年度はUVスペクトル解析、電気泳動解析、円偏光二色性（CD）解析を中心として実施し、表面プラズモン共鳴(SPR)を2020年度に行うことにしたため、試薬と消耗品費に残額が生じた。SPRに必要なチップと試薬については2020年度に購入する。
（使用計画）
2020年度は動物実験を行う費用が必要となり、2020年度分として請求した助成金(1,000千円)と合わせて、試薬・物品・実験動物購入費用として1,500千円、論文投稿費用として200千円、学会発表のための参加費・旅費として180千円を使用する計画である。
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