立体構造情報にもとづく制限酵素FokIのDNA切断反応機構の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K04859
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 加藤 義雄 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (20415657)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹下 大二郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80613265)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 制限酵素 / 構造解析 / タンパク質 / DNA / FokI / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

Type IIS制限酵素は特定のDNA配列を認識し、認識配列とは離れた箇所においてDNAを切断する。しかしながらType IIS制限酵素が、どのようにして認識配列から正しい距離を測って切断箇所を決めているのか、どのような触媒機構でDNAを切断しているのか、まだ不明な点が多い。これまでに報告されてきたFokIの結晶構造は、FokIの触媒中心とDNA上の切断箇所が遠く離れており、活性構造ではないことが明らかとなっている。そこで本研究では、X線構造解析によりFokIと基質DNAとの複合体の結晶から、活性型の構造を解き明かすことを目的とする。
１年目においては、第一に、大腸菌においてFokIタンパク質を発現精製する条件を決定した。FokIMメチラーゼを微量に発現させることによりFokIRタンパク質を効率よく発現させることに成功した。次に、結晶化条件について検討を実施した。基質DNAの周辺構造により結晶化が異なることが予想されたことから、複数の基質DNA配列を用いた。数百種類の結晶化条件を検討したところ、特定の基質DNA配列と沈殿剤の組み合わせにおいて、回折像の見られる結晶を得ることに成功した。今後は現在得られている結晶化条件をさらに細かく検討することにより、分解能の高い結晶を獲得し、結晶構造を解析する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画では１年目に結晶化を行うこととしており、本研究の成果として回折像の見られる結晶を得ることに成功した。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画では２年目以降において、得られた結晶を元にX線構造解析を行うこととしている。計画通り、X線結晶構造解析を実施する。

Causes of Carryover

概ね計画通りに進められたところではあるが、タンパク質の精製条件において当初計画していたプロテアーゼ切断を実施しなくとも良好な結晶が得られたため、消耗品を安価にすることができた。翌年度以降は結晶化条件を拡大させ、予算を満額実施する予定である。