立体構造情報にもとづく制限酵素FokIのDNA切断反応機構の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K04859
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 加藤 義雄 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (20415657)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹下 大二郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80613265)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 制限酵素 / タンパク質 / DNA

Outline of Annual Research Achievements

制限酵素は、自己DNAと非自己DNAを区別して認識し、ウイルス等の外来生物等から宿主細胞を保護するための自然免疫の役割を果たしている。Type IIS制限酵素は特定のDNA配列を認識し、認識配列とは離れた箇所においてDNAを切断するが、どのようにして認識配列から正しい距離を測って切断箇所を決めているのか、どのような触媒機構でDNAを切断しているのか、まだ不明な点が多い。その詳細な認識メカニズムを知る上では、結晶構造解析を利用した原子座標の決定が必要となるが、これまでに報告されてきたFokIの結晶構造は、FokIの触媒中心とDNA上の切断箇所が遠く離れており、活性構造ではないという問題点があった。そこで本研究では、切断条件に近似した条件において、FokIと基質DNAとの複合体の結晶から、活性型の構造を解き明かすことを目的としている。
昨年度までに最適化したFokIタンパク質を発現精製条件を用いてFokIRタンパク質を精製し、DNAとの複合体の結晶化を行ってきた。これまでは、精製したFokIRタンパク質と化学合成DNAを、結晶化のためのリザーバーへと添加し結晶が成長する条件のスクリーニングを行ってきたが、これらの条件において、結晶の回折像が得られたものの、いずれも構造決定できるほどの解像度が得られなかった。そこで今年度は、精製したFokIRタンパク質とDNAを混合した後に再度ゲル濾過カラムにより複合体を分取し、結晶化条件のスクリーニングを実施している。当初の想定とは異なり、FokIRタンパク質とDNAは4量体を形成し巨大分子として機能していることが示唆された。次年度以降において、X線結晶構造解析に加えて、クライオ電顕による構造解析の検証を行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

タンパク質とDNAが1:1複合体を形成することによってX線回折像が得られると考えてきたが、巨大複合体の形成により、高解像度の回折像が得られないという結果が示唆されたため。またコロナ禍により出勤制限がかかり、多くの解析が困難となったため。

Strategy for Future Research Activity

X線結晶構造解析だけではなくクライオ電顕を利用した構造解析の検証も実施する。

Causes of Carryover

コロナ禍により出勤が制限される等の影響により、研究実施に遅れが生じたため。