Structural basis of DNA cleavage by FokI restriction enzyme

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K04859
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 加藤 義雄 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (20415657)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹下 大二郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80613265)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 制限酵素 / タンパク質 / DNA

Outline of Annual Research Achievements

FokIに代表されるType IIS制限酵素は、ゲノム編集や人工遺伝子合成に活用されている。本研究では、FokIと基質DNAとの複合体の結晶構造を解き、速度論実験と合わせて、その詳細な反応メカニズムを解明することを目的とする。FokIはGGATG配列を認識し、9塩基離れた箇所で配列非依存的にの二本鎖DNAを切断する。しかしながら、FokIが、どのようにし て認識配列から正しい距離を測って切断箇所を決めているのか、どのような触媒機構でDNAを切断しているのか、今もって不明である。
本研究では、FokIタンパク質発現条件の最適化と、精製条件の最適化を行った。まず、FokIサイトを認識してメチル化するFokIM遺伝子を大腸菌内で発現誘導する系を構築した。続いてDNAを切断するFokIR遺伝子を発現するpET-FokIRベクターを構築し、FokIRタンパク質を精製した。DNAとの複合体における結晶を得るため、結晶化条件のスクリーニングを行ったところ、複数の条件において結晶化条件が見つかった。しかしながら、X線解析では解像度が低い結果しか得れられず、さらなる条件検討を実施したものの、構造解析可能な結晶を得ることはできなかった。ゲルろ過クロマトグラフィーによる生化学解析の結果、FokIタンパク質とDNAは多量体を形成し巨大複合体として存在していることが明らかとなり、複雑な構造を形成していることが予想されたため、当初計画していたX線結晶構造解析ではなく、クライオ電子顕微鏡による解析が適しているものと想定される。