2018 Fiscal Year Research-status Report
センサータンパク質を駆動系とする人工タンパク質超分子マシンの構築
| Project/Area Number |
18K04906
|
|---|
| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
山中 優 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (60632825)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 四次構造変化 / タンパク質超分子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度は、シトクロムc’(CP)とヤツメウナギヘモグロビン(LHb)を対象として以下の研究を実施した。
1）好熱菌CP(PHCP)のCO応答性改変と超分子化：CO結合に伴い2量体―単量体構造変化を示す常温菌CP(AVCP)では、既にドメインスワッピングにより超分子化すること、さらにこれがCO応答性構造変化を維持していることが明らかとなっている。そこで、AVCPの相同タンパク質でより安定性の高い好熱菌CP(PHCP)を標的として、同様に超分子化を試みた。大腸菌発現系で異種発現させ各種カラムで精製したPHCPのCO結合能を評価したところ、AVCPよりもCO親和性が著しく低いことが明らかになった。また、AVCPで見られるようなCO結合に伴う2量体―単量体構造変化は、PHCPでは観測されなかった。そこで、PHCPの2量体界面の3残基をAVCPの対応する残基に置換した変異体(F11T、T18F、F71D)を作成し、CO親和性と応答性を調べたところ、全変異体でCO親和性が上昇し、さらにT18F、F71DではCO結合に伴う2量体―単量体構造変化も示した。T18F・F71D変異体の超分子化を試みたところ、酢酸処理により4量体より大きい多量体が得られた。さらに、この多量体はCO結合に伴い2量体に解離することも見出した。現在この多量体の構造解析を進めている。
2）LHbの超分子化：酸素結合に伴い2量体―単量体構造変化を示すLHbを標的に、ドメインスワッピング超分子化を試みた。LHbを各種アルコールで処理したが、多量体は得られなかった。現在は、その他の条件での超分子化の検討を進めるとともに、LHbと構造類似性があり既にドメインスワッピング超分子化することが分かっているミオグロビンの構造を参考にし、超分子化しやすくなるよう設計したLHb変異体を作製し、超分子化を調査中である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
設定課題1．「センサータンパク質のドメインスワップ超分子化と動作機構への影響評価」に関して、CPのCO結合に伴う構造変化を維持した超分子化については、AVCPの実績をもとに、より安定なPHCPでも成果が得られつつある。その内、PHCPのCO応答性構造変化の改変について国際学術雑誌に掲載された。LHbについては、野生型でのアルコールでの条件検討を完了し、さらなる条件検討および超分子化しやすくなるよう設計した変異体の超分子化にも着手しており、計画通り順調に進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
設定課題1．「センサータンパク質のドメインスワップ超分子化と動作機構への影響評価」に関して、CPとLHbについてのテーマを引き続き進展させるとともに、その他のセンサータンパク質、カルモジュリンおよびHrtRの超分子化についても着手する。さらに、CPについては設定課題2．「タンパク質改変による任意構造をもつ超分子構築と動作機構への影響評価」にも着手する。
|
| Causes of Carryover |
消耗品等が現在研究室にあるもので研究遂行可能であった為、新規に購入する必要がなかった為。次年度使用額は、当初予定を変更して新たに導入予定の微量分光光度計の購入費用の一部に充てる。
|
