2020 Fiscal Year Research-status Report
Computational modeling and analysis of glycosyl hyrolases : reaction mechanism and catalytic design
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18K05052
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
石田 豊和 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 主任研究員 (70443166)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Glycoside hydrolase(GH) / キシラナーゼ（Xylanase） / 酵素反応機構 / QM/MM計算 / 自由エネルギー計算 / グリコシル化反応 / 基底状態不安定化 / 基質歪み |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、非経験的量子化学計算と分子動力学計算を組み合わせた複合シミュレーション技術の開発と拡張を基礎として、バイオマス分解酵素の一つであるキシラナーゼ（Xylanase）に適用することで、一般には遅い反応だと考えられているグリコシド結合の分解過程を詳細に解析する手法を開発し、実在の酵素反応系で大規模計算を実行して、本酵素反応の律速段階を同定して反応機構を解明することにある。
本研究対象であるXylanase はGlycoside hydrolase(GH)と総称される酵素の一種であり、植物細胞壁を構成するヘミセルロースの加水分解を触媒する酵素として知られる。現在では様々な種に由来するXylanaseの実験研究、また酵素の立体構造が報告されているが、触媒反応の本質であるβグリコシド結合加水分解メカニズムに関しては定性的な理解にとどまり、定量的な量子化学計算に基づく化学反応のエネルギー収支、触媒活性因子の同定には至っていない。そこで我々は独自の計算プログラムを活用し、また中性子構造と高分解能X線構造を組み合わせた酵素基質複合体構造の精密な分子モデリングを基に自由エネルギー計算を実行しグリコシド結合分解過程を解析した。
QM/MM-MP2構造最適化に基づく反応自由エネルギー変化から、反応過程の前半(Glycosylation)での律速過程は（従来から指摘されている）プロトン移動ではなく、グリコシド結合の分解過程であることが明らかとなり、また反応中間体である Glycosyl enzyme 形成過程の間に、ごく短時間ながら oxocarbenium ion 中間体が確かに生成されることを理論計算の観点から実証した。また酵素基質複合体中での基質の構造歪みは若干であるが認められ、oxocarbenium ion 中間体を形成する際には明確な糖鎖構造の歪みが理論計算からも確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の最大の注目点は、GHファミリーの実験構造（GH22、卵白リゾチーム）が最初に解明された半世紀以上も前から議論の続く作業仮説「グリコシド結合の加水分解過程でOxocarbenium ionが反応中間体として実際に生成しうるか否か」に関して、理論計算化学から明確な回答を提示することにある。入手可能な最新の実験データを基にQM/MM-MP2 レベルの構造最適化／反応経路の同定、そして CCSD(T)レベルの補正を加えた上での自由エネルギー計算により反応プロファイルを半定量的に理論計算から算出し、この結果をもとに反応機構の詳細が議論できた。
特に理論計算の視点から、基底状態の不安定化（基質歪み）の触媒活性への影響を半定量的に示し、また反応経路の途中でOxocarbenium ion中間体が確かに形成されうること、そして反応種の寿命も理論計算から見積もり、入手可能な実験事実と合わせて矛盾のない反応メカニズムを提案することが出来た。これらは天然型酵素を対象とした理論計算の結果であるが、研究課題前半の最大の課題であった基本反応メカニズムの同定はほぼ計算解析が完了したので、以後は各種反応因子を変化させた場合の反応活性変化の解明へと繋ぐ。
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| Strategy for Future Research Activity |
天然型酵素を対象とした基本反応メカニズムの解析過程において、計算手法に基づく影響（電子状態計算／基底関数レベルの検討、反応経路の適切な選択、初期構造由来の構造モデルの妥当性、等）を一通り考察したので、以後は天然型酵素のプロファイルを基礎として、外部摂動の影響を自由エネルギー変化を通して解析する。
特にGH系酵素の特徴として、酵素反応の最適温度や最適pHが大きな幅を持つことが知られているので、我々の計算対象である GH11 Xylanase を対象とした反応温度依存性、また局所的な pH 環境依存性をQM/MMレベルの分子モデリング／シミュレーション解析を基礎として解析していく。
本研究は米国 Oak Ridge National Laboratory (ORNL)の研究グループとの共同研究として実施するので、今後の研究環境の変化も想定しつつ、適切な共同作業／ディスカッションを行って研究を継続する。
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| Causes of Carryover |
本研究の本質は日米間の国際共同研究（また同時に、理論計算と精密構造解析技術の共同研究）であるので、研究開始当初から米国での短期滞在を繰り返す在外研究を想定していた。しかし過去２年に渡り社会状況に大きな変化が発生したので、想定していた渡米費用／また国内外での学会参加費用は次年度に繰り越す方針とした。
恐らく今年度も米国での共同研究は困難だと考えられるため、繰り越した予算の多くをワークステーションの追加購入費用に充てて、共同研究先で予定していた計算実行は国内で実施し、共同研究に関する打ち合わせや論文作成などは、メールやウェブ会議ベースで実施する方針へと変更する。
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