2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel bacterial detection methods using bacteriophages as recognition elements
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18K05174
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
渡辺 茂 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (70253333)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松崎 茂展 高知大学, 医学部, 特任准教授 (00190439)
仁子 陽輔 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 助教 (20782056)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細菌検出 / バクテリオファージ / 金ナノ粒子 / 暗視野顕微鏡法 / 光散乱 / プラズモニクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微生物検査は，感染症や食中毒の予防・衛生管理の面から重要である．しかし，培養に基づく従来法では検査に2～10日を要し，病原菌の特定に至っても手遅れになる場合が多く，検査の迅速化・簡易化が強く求められている．近年，PCRや抗原抗体反応を利用した迅速検査技術が開発されているが，遺伝子解析には煩雑な操作や高額な機器が必要である．また，細菌の中には，宿主免疫を回避するような防御機能を備えているものもあり，遺伝子解析や免疫反応に依らない新奇な検出原理が求められている．
バクテリオファージ（以下，ファージと省略する）は，細菌特異的に感染するウイルスの総称であり，標的細菌を特異的に識別する機能を備えている．その機能を自在に活用できるようになれば，遺伝子や免疫検出法に代わる迅速かつ簡便な細菌検出法への応用が期待できる．本研究では，ファージと強力な散乱光を発する金ナノ粒子から形成される新奇なプラズモニックプローブと暗視野顕微鏡法を組み合わせた細菌検出技術について検討した．
金ナノ粒子とファージから形成されるファージプラズモニックプローブは，金ナノ粒子（d = 30 nm）をガラスビーズ（d = 300 nm）上に集積した後，その表面にファージを自己組織化することで調整した．これを検体と混合するとファージを介して細菌表面にプローブが凝集し，強力な散乱光を発するようになる．これを光学顕微鏡（「暗視野顕微鏡法」）で観察することによって，試料混合後10分～15分程度で標的細菌を検出できることを突き止めた．また，その選択性は，プローブに担持させたファージの宿主特異性に依存していることを確認した．本手法は，担持させるファージを変えることによって，特定菌種への選択性を自在に制御することが可能であり，迅速かつ簡便な細菌検出法への応用が期待できる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では，ファージプラズモニックプローブと暗視野顕微鏡法を組み合わせた細菌検出技術の開発をめざしている．初年度は，ファージプラズモニックプローブの調整方法について検討し，本年度は昨年予備的成果として得られた標的細菌の検出について，再現性を確認し，光散乱を利用する新奇な細菌検出技術の原理実証に成功した．．
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| Strategy for Future Research Activity |
新奇な細菌検出用バイオ素材として，バクテリアファージの活用をめざす本研究では，3つの到達目標を掲げている．
【研究目標1】“ファージ機能制御技術”の開発：ファージは，細菌に感染し菌体を溶かして増殖するウイルスであり，ファージのライフサイクル（吸着，侵入，生合成，成熟，放出）の内，吸着機能のみ発揮させる方法について検討する．
【研究目標2】 “ファージ組織化技術”の開発：ファージの宿主特異性は尾部にあり，標的細菌に対して高い結合力を発揮するためには，ファージの配向を制御しながら組織化する必要がある．ファージの機能を最大限に発揮させる組織化技術を開発する．
【研究目標3】 “ファージナノプローブ”の開発：ファージの細菌認識現象を検出可能な物理信号に変換するバイオインターフェイスを開発する．
本年度は，研究目標3についてファージナノプローブと暗視野顕微鏡法を利用した細菌検出法の原理実証を達成した．次年度は，その有用性を①感度②選択性③安定性④迅速性⑤即応性の観点から検証する．また，金ナノ粒子に代わって蛍光性ナノエマルションを利用した“ファージ蛍光ナノプローブ”の開発についても取り掛かっており，引き続き検討する．さらに，ファージナノプローブの保存安定性を高め，ファージの感染能力の有無を確認するなど一部未着手であった研究目標1について検討する．
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| Causes of Carryover |
（理由）学内の競争的資金を獲得したこともあり，光学顕微鏡のカラー化，蛍光分光計の分光用クライオスタットなど主要分析機器の機能強化経費を学内競争資金より支出した．そのため当初計上していた物品費が予定額を下回った．
（使用計画）次年度は最終年度であり，金ナノ粒子を作製する無機合成試薬および蛍光色素やナノエマルションを作製する有機合成試薬の購入，および前年度実施できなかった各種分析機器の保守点検を計画している．
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