2018 Fiscal Year Research-status Report
核膜選択的な蛍光ラベル化技術を活用した細胞核の動態解析
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18K05177
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
末田 慎二 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (00325581)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 核膜 / 蛍光ラベル化 / 核膜崩壊・再構成 / 核内膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ビオチンリガーゼがビオチン化された基質タンパク質と非常に安定な複合体を形成するという性質を有する特異なビオチン化酵素反応を利用して、核膜を選択的に蛍光ラベル化することできる技術を開発し、細胞分裂過程における核膜の動態解析を行うことを目的としている。今年度はまずこのラベル化技術を利用して、核膜を正常にラベル化できるかどうかを検証するために、核内膜を裏打ちするラミナを構成するラミンタンパク質との同時蛍光イメージングを行った。その結果、細胞の静止期（間期）においては、ラミンタンパク質と核膜の分布が完全に一致しており、また、核膜の形状に異常は見られなかったことから、本ラベル化技術を利用して、核膜を正常な状態で選択的にラベル化できることが実証できた。
一方、本ラベル化技術では、２種類の融合タンパク質を細胞内で発現させる必要があるが、これまではそれら２種類の融合タンパク質について別々に発現プラスミドを作成し、それらを同時に細胞に導入することによりラベル化を行ってきた。しかしこの場合、２種類の発現プラスミドが適切な量、細胞に導入されて初めて核膜のラベル化がなされるため、ラベル化された細胞を観察できる確率が限定的なものとなっていた。そこで今年度は両融合タンパク質の遺伝子を単一の発現プラスミドに挿入にして、１種類のプラスミドを導入するだけでラベル化が可能な系を構築した。具体的にはInternal Ribosomal Entry Siteを介して両タンパク質を一本のmRNAとして発現させるプラスミドを作成した。さらに検出感度の向上させることを目的として、発光特性のすぐれた蛍光タンパク質をプローブとして利用したラベル化系も構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究で活用する核膜の蛍光ラベル化技術の性能を評価し、当初の予定どおり、２種類の融合タンパク質を同時に発現させる系の構築に成功し、また蛍光検出感度を向上させることが可能な蛍光プローブの作成にも成功したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
最適な条件下で核膜の蛍光ラベル化を行い、そのラベル化された細胞についてタイムラプスイメージングを行い、細胞分裂過程における核膜の動きを追跡する。ここでは、小胞体などの他の膜組織全体をラベル化するために、小胞体のマーカータンパク質と蛍光タンパク質の融合体を共発現させる。そして、細胞分裂過程において、核膜を構成していた脂質膜がどのように小胞体などの脂質膜と融合し、さらに分裂した細胞にどのように再分配されるかについて詳細に解析を行う。また、細胞分裂過程の各段階（前期、中期、後期、終期など）を識別するために、染色体の蛍光ラベル化も試みる。ここでは、ヒストンと蛍光タンパク質の融合体を共発現させることにより、染色体の動きも同時に追跡する。また、現在一般に受け入れられている核膜の崩壊・再構成のメカニズムでは、核膜は崩壊後、小胞体に吸収され、その独自性を失うものと考えられている。しかし我々のこれまでの検討からは、このメカニズムに反する結果が得られている。そこで、このような核膜の動態に関する新たなメカニズムを提唱するのに必要なデータを取得することに重点をおいて研究を進める。
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| Causes of Carryover |
今年度の助成金については物品の購入のみに充てたため、次年度使用額が生じた。その未使用分と併せて次年度の助成金については、物品費と旅費に充てる予定である。
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