2018 Fiscal Year Research-status Report
人工細胞膜との特異的膜融合を利用するエクソソーム膜タンパク質の高感度計測法
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18K05182
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
東海林 敦 東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (90459850)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 脂質二分子膜 / グラミシジン / エクソソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体試料中に含まれる，ありとあらゆる細胞から放出されるエクソソームのうち，腫瘍細胞由来のエクソソームのみを膜融合する人工細胞（巨大一枚膜リポソーム）を設計するために，エクソソームと人工脂質二分子膜の膜融合アッセイ法を確立した．これまでに，支持脂質二分子膜に包埋されたグラミシジンチャネルの活性（コンダクタンス値）が，エクソソームの膜融合により増大することを明らかにしてきた．当該年度では，このコンダクタンス値が増加するメカニズムを解明することで，グラミシジンチャネルの変調に基づく膜融合アッセイ法の有用性を確認した．
ホースディング法により平面脂質二分子膜を作製し，グラミシジン包埋後のシングルチャネル電流を記録した．その後，エクソソームを膜融合させてから，再びチャネル電流を記録したところ，シングルチャネルがマルチチャネルへと変化した．単位時間当たりの積分電流値は，支持脂質二分子膜へのエクソソームの添加により，大きな値を示した．また，エクソソームを支持脂質二分子膜に包埋させた後，グラミシジンを添加してシングルチャネルを記録すると，HEK 293（ヒト胎児腎細胞） や MCF-7 細胞（ヒト乳腺癌細胞）から放出されたエクソソームでは，膜融合前後でシングルチャネル活性に大きな違いは見られなかった．これらのことから，申請者らが構築した膜融合アッセイにおけるエクソソーム膜融合時のグラミシジンチャネルのコンダクタンス値の増加は，膜融合に伴い，脂質二分子膜に包埋されるグラミシジンの分子数が増加したものであると考えられる．本アッセイ法で膜融合と pH の関連を調べたところ，pH が低いほどエクソソームが脂質二分子膜と膜融合しやすいことがわかった．さらに，HEK 293 細胞と比較して，MCF-7 細胞由来のエクソソームは膜融合が容易であった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では，単一の巨大一枚膜リポソームの膜に，生体試料中の腫瘍細胞のみを選択的に膜融合させることで濃縮し，腫瘍細胞特有の膜タンパク質をバイオマーカーとして ELISA の原理で検出するシステムを構築する．そのためには，腫瘍細胞由来エクソソームの選択的な膜融合を可能にするための巨大一枚膜リポソーム（人工細胞）の設計と，単一の巨大一枚膜リポソームを基板に固定化するための方法を考案する必要がある。現在の進行状況に鑑みると，おおむね順調に進んでいると評価できる．これまでに行った研究内容を下記に記す．
腫瘍細胞由来のエクソソームのみを選択的に膜融合させることができる人工細胞を設計することが、当該年度の研究計画であった．その手段として，人工細胞膜の脂質組成や膜界面のデザインを行うことが必須であると考えられる．しかしながら，本研究で構築した膜融合アッセイで支持脂質二分子膜とエクソソームの膜融合を評価すると，pH が低い場合には，エクソソームが非特異的に膜融合するものの，中性付近では腫瘍細胞 (MCF-7) 由来のエクソソームが選択的に膜融合することが明らかになった．つまり，膜融合に膜タンパク質の寄与はそれほど大きいものでないことが示唆される．一方，pH を中性付近にするだけで，人工細胞に腫瘍細胞由来のエクソソームのみを選択的に膜融合させることができる．
単一の巨大一枚膜リポソームをガラス基板に修飾するための基礎検討を行った．CO2レーザー加工機で作製した直径 100 μm 程度の小孔を有するフィルムでマスクすることで，ガラス基板の微小領域内（100 μm)にアビジンを化学修飾した．そこにビオチン化巨大一枚膜リポソームを固定化することに成功した．この単一リポソームにエクソソームを膜融合させるための基礎検討はすでに終えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では，全ての細胞から分泌されたエクソソームや夾雑成分が含まれる血液から，ガン細胞由来エクソソームのみを人工細胞（巨大一枚膜リポソーム) の膜に融合させ，その膜 (膜厚: 4-5 nm) に濃縮された多種多様な膜タンパク質のうち，目的の膜タンパク質のみを特異的に蛍光イムノアッセイの原理で検出する方法を構築する．このような計測技術を構築する上で必要な検討事項を下記にまとめた．
１）正常細胞よりも腫瘍細胞から放出されるエクソソームの方が、膜融合速度が速いことを示す．： 当該年度に行った研究では，ph 7.4 において HEK293 細胞から放出されたエクソソームは，人工脂質二分子膜と膜融合せずに，腫瘍細胞 (MCF-7) から放出されるエクソソームは容易に膜融合することが示された．この傾向が，多くの腫瘍細胞由来エクソソームにも該当するか調べるために，複数種類の正常細胞や腫瘍細胞から放出されるエクソソームと脂質二分子膜の膜融合を調べる．
２）巨大一枚膜リポソームとエクソソームの膜融合を調べる．： パッチクランプ技術を用い，単一の巨大一枚膜リポソームとエクソソームの膜融合をグラミシジンチャネル活性を指標として評価する．pH による膜融合の挙動の差異を調べ，腫瘍細胞のみが選択的に膜融合する実験条件を最適化する．
３）巨大一枚膜リポソームのアレイ化法の確立と蛍光イメージング装置の開発： レーザー加工機でマスクを作成し，ガラス基板上にアビジンをアレイ状に化学修飾できることを示す．これにビオチン化巨大一枚膜リポソームをアレイ状に固定化する．また，巨大一枚膜リポソームアレイを，単一リポソームレベルで蛍光検出するための装置を開発する．光源として，ダイオードレーザーを選択し,フィルターを搭載した倒立顕微鏡下で蛍光画像を観察するシステムを作成する．
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| Causes of Carryover |
当該年度の研究活動では，助成金を高額な抗体やエクソソームなどの消耗品を購入するのに使用してきた．研究成果は，おおむね当初の予定通りに進んでいる．一方，検討すべき項目として，単一の巨大一枚膜リポソームを固定化する技術が挙げられる．複数の固定化法を検討していく中で，当初の予定には含まれていないものの，ガラスの穴あけ加工が必須であることがわかってきた．そのため，次年度の巨大一枚膜リポソームの固定化技術を構築する上で，当該年度の残額 9,928円を使用することにした．
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Research Products
(4 results)
