2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of the sensitive methods for detection of the fluorinated compounds bound to the target proteins
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18K05185
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| Research Institution | Meisei University |
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Principal Investigator |
田代 充 明星大学, 理工学部, 教授 (40315750)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉村 悦郎 放送大学, 教養学部, 教授 (10130303)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 分子間相互作用 / タンパク質 / フッ素化合物 / 核磁気共鳴法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請課題では、標的タンパク質（レセプター）と結合するフッ素化合物（リガンド）の検出において、フッ素原子（19F）をマーカーとして、高感度および選択的に検出できる核磁気共鳴法（NMR）の開発を目指した。標的タンパク質に親和性のあるリガンドの19F―高感度選択的検出を行い、分子間相互作用に関与するリガンド中の部位を、フッ素原子に着目して検出し、水素原子核を含めた原子レベルで解析できる分析手法である。タンパク質としてヒト血清アルブミン、フッ素化合物としてジフルニサル、エノキサシンを使用した。ジフルニサルとヒト血清アルブミンの複合体に関しては、X線結晶構造解析がなされており、参考となる立体構造情報が得られるため、モデルシステムとして適しているものと考えた。
実際のNMR測定では、1H照射－1H検出飽和移動差（STD）スペクトルにより複合体形成を確認した後に、1H照射－19F検出STDスペクトル測定を行い、結合するリガンド中のフッ素核を直接検出した。長所として、軽水溶液(95% H2O+5% D2O)においても、レシーバーの飽和を気にせずに選択的検出が可能である。短所として、１H検出スペクトルより感度が大幅に低下したことであった。
高感度化を目指して、最初に行うタンパク質の1H照射パルスの検討を行った。これまで使用したハードパルスの他に、Gaussian, squareなどの低出力のshaped pulse を使用して、感度に及ぼす影響を調べた。タンパク質のメチル基照射では、Gaussian, およびQ3パルスの使用により比較的高感度なスペクトルが観測された。今後、これらのパルス幅や出力などの詳細な条件検討を行うことが必要と考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
パルスシーケンスの最初にタンパク質の1Hを選択照射する。このパルスの検討において、タンパク質のメチル基照射領域を0.4-2.0 ppmに設定し、照射によりフッ素化合物の磁化に影響を与えないことを確認した。
従来使用したハードパルスとshaped pulseで測定したスペクトルとの感度比較を行ったところ、Gaussian, およびQ3パルスの使用により比較的高感度なスペクトルが観測された。他に使用したshaped pulseは、IBURP1、IBURP2、G3、squareなどのインバージョンパルスである。特にGaussianパルスで1.5秒間照射した1H照射－19F検出飽和移動差（STD）スペクトルでは、感度（SN比）が約15％増加し、良好な結果が得られた。
水シグナルを選択照射するWaterLOGSYタイプの測定を現在行っており、同様にハードパルスとshaped pulseの比較検討を行っている。メチル基照射領域より、水シグナルの照射領域が4.4-4.6 ppmと狭くなるため、パルス幅や出力の微妙な調整をしながら感度との関連性を検討中である。
1H, 19F検出によるヒト血清アルブミンージフルニサル複合体の相互作用解析に関しては研究成果発表として、学術雑誌に投稿し受理された（Magnetochemistry, 2019, 5(1), 1）。
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| Strategy for Future Research Activity |
水シグナルを選択照射し、水の1H磁化をタンパク質の1Hに移動させ、更にタンパク質に結合するリガンドの1Hに移動させて検出するWaterLOGSY 法がある。この測定では、結合するリガンドの1Hシグナルと結合しない化合物の1Hシグナルが逆の位相で観測される。従って、結合の判別が容易である長所を有する。また、メチル基を有するリガンド分子の場合、タンパク質の選択照射領域にメチル基領域を選択できない制限が発生するため、水シグナルを選択照射するWaterLOGSY 法の汎用性は高いものと期待できる。
この特徴を活かし、フッ素で検出するWaterLOGSY 法の開発を行う。原理としては、水の1H磁化をタンパク質の1Hに移動させ、更にタンパク質に結合するリガンドの19Fに移動させて検出する。水シグナルの選択励起パルスの検討が必要になる。
時間的余裕がある場合、DNAなどの核酸の検出方法として、31Pによる測定法の開発を行う。DNAと相互作用するタンパク質には生化学的に重要なものが多く、31Pによる溶液状態でのDNAの検出は有意義なものと期待できる。
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| Causes of Carryover |
核磁気共鳴装置の超伝導磁石の維持に必要な液体ヘリウムの価格が国際的に高騰しており、2019年度には更なる価格高騰が予想されるため、次年度（2019年度）使用額が発生している。また、ドイツで開催されるEURO-NMR学会での研究成果発表を予定しているため。
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