2018 Fiscal Year Research-status Report
Rapid and highly sensitive determination of fatty acids in human blood by multistep reactive pyrolysis
| Project/Area Number |
18K05186
|
|---|
| Research Institution | Chubu University |
|---|
Principal Investigator |
石田 康行 中部大学, 応用生物学部, 教授 (70273266)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮澤 大介 金城学院大学, 薬学部, 准教授 (70434553)
岩崎 雄吾 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (50273214)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 脂肪酸 / 反応熱分解 / 多価不飽和脂肪酸 / 脂肪酸プロファイル / 血液 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、血液を含浸させたろ紙試料をミクロ反応炉内に導入した後、血中脂肪酸のメチル化と気化を、遊離型とエステル結合型の順番で連続して行える二段階反応系を構築することを試みた。反応試薬としては、ステップ1では、遊離脂肪酸のメチル化のみを引き起こす酢酸テトラメチルアンモニウム（TMAAc）を、また、ステップ2ではエステル結合の加水分解とそれに引き続くメチル化反応の双方を有機できる水酸化テトラメチルアンモニウム（TMAH）を選択した。装置構成としてはミクロ反応炉を備えたガスクロマトグラフ/質量分析計（熱分解GC/MS）を使用した。測定手順としては、まず、TMAAc存在下で試料成分を一旦反応熱分解GC測定し、試料中の遊離脂肪酸成分を一旦分析し（以上がステップ1）、次いで、試料カップ中にTMAHを添加した後、再度反応熱分解GC測定し、今度はエステル結合型の脂肪酸成分の検出を行う（以上がステップ2）方策を採用した。各ステップにおける反応条件（反応温度および反応時間）を最適化した結果、ステップ1では300℃において30秒間、ステップ2では400℃下での反応を通じて脂肪酸成分が最も高効率に対応するメチル化体に変換されることを見出した。これらの条件下で脂質試料を2段階方式で反応熱分解GC/MS測定して得られたクロマトグラム上には、それぞれ遊離型およびエステル型の脂肪酸成分が選択的かつ高感度に観測された。以上のように、本年度の検討を通じて、遊離型およびエステル型の2種類の脂肪酸成分を区別しながら定量できる、二段階反応系を構築することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度には、もともと1) 反応性の異なる試薬を段階的に活用した多段階反応と2) 酵素反応を採用した新規反応場の構築の2つを検討項目としていた。それらのうち、前者についてはほぼ検討が終了したが、後者についてはその基礎検討しか行うことができなかった。その一方で、当初、2年目に予定していた高速ガスクロマトグラフィーシステムとの連結や、マルチステップ反応熱分解GCシステムの性能評価の一部を前倒しのかたちで実施することができた。以上のことから、上記（2）の自己評価を行った。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今年度開発した、2段階式の反応熱分解系に対して、新たに酵素分解プロセスを加味した多段階反応を構築する。ここではリン脂質に結合した脂肪酸に特異的に作用する分解酵素と、反応性の異なるメチル化試薬類を段階的に組み合わせて用いる。これにより、リン脂質と中性脂質に結合した脂肪酸を区別してメチル化と気化が行える。以上の反応系で用いる試薬種や反応温度等の条件の制御を通じて、①遊離型、②リン脂質結合型、および③中性脂質結合型の３種類の状態で存在する脂肪酸類を連続してメチル化体へと変換できるマルチステップ反応熱分解システムを今年度中に完成させる。さらに、この方法を実際の人血中の脂肪酸分析に応用して、当該成分の存在状態ごとの高感度定量を実現する。
|
| Causes of Carryover |
平成30年度の実験が効率よく進んだ結果、消耗品の支出が予定より少額となり、その一部を繰り越すこととなった。なお、残額は反応試薬等の消耗品に充てる予定である。
|
