Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for depression biomarker ethanolamine phosphate

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05188
• Research Institution: Sojo University
• Principal Investigator: 齋田 哲也 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (80419621)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: エタノールアミンリン酸 / バイオマーカー / 酵素免疫測定法 / うつ病

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、うつ病のバイオマーカーとして期待されているエタノールアミンリン酸（EAP）の特異的かつ簡便な酵素免疫測定法を開発することを目的としている。実験計画書通りにEAPに架橋剤であるピロメリット酸無水物を反応させ架橋し、EAPが導入された部分を強く認識する特異抗体を作製することを試みた。すなわち、EAPにピロメリット酸無水物を反応させ、これをウシ血清アルブミンと結合させ、EAP抗原を作製した。これをマウスに免疫後、抗血清を得た。得られた抗血清の抗体力価や特異性を検討した結果、EAPに対する特異抗体は得られなかった。その理由として、架橋剤として使用したピロメリット酸無水物の分子サイズが大きいため、EAPではなくピロメリット酸無水物に対する抗体が産出されたためと考えられた。そこで、新たな架橋剤である4-maleimidobenzoic acid Nhydroxysuccinimide ester (MBS)を用いて、抗原を作製し、マウスに免疫後、抗血清を得た。得られた抗血清の抗体力価や特異性を検討した結果、EAPに対して 高力価で特異的な抗体が得られた。次にEAP抗原と同様な作製方法により、EAPとペルオキシダーゼ（HRP）複合体すなわち酵素標識体を作製した。得られたEAP抗体とHRP標識を使用し、マイクロプレートを用いた酵素免疫測定法の開発を試みた。現在の所、生体内試料（血清、尿、唾液）中のEAP濃度80 ～ 1000 ng/mlを再現性よく測定できる、酵素免疫測定法の開発に成功した。EAPの血中濃度は、数百ng/mlで推移することから、十分に臨床応用可能な感度であった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

実験計画書通りにEAP抗原をピロメリット酸無水物を用いて作製し、これをマウスに免疫後、抗血清を得た。得られた抗血清の抗体力価や特異性を検討した結果、EAPに対する特異抗体は得られなかった。そこで、試行錯誤を繰り返し、架橋剤であるMBSを用いることで、EAPの特異抗体を得ることに成功した。しかしながら、現在の所、生体内試料（血清、尿、唾液）中のEAP濃度80 ～ 1000 ng/mlを再現性よく測定できる、酵素免疫測定法の開発に成功し、開発した酵素免疫測定法が、実際に臨床応用可能であるか確認するために、既に確立されているEAPのHPLC法と本法とのEAP定量性の比較実験を検討しているところである。
当初の計画では、令和元年度中に、HPLC法と本法とのEAP定量性の比較実験を完了する予定であったが、やや遅れている状況である。現在、HPLCの分析は、他大学に依頼しているが、新型コロナウイルスの影響で中断している。

Strategy for Future Research Activity

得られたEAP抗体とHRP標識を使用し、マイクロプレートを用いた酵素免疫測定法の開発を試み、生体内試料（血清、尿、唾液）中のEAP濃度80 ～ 1000 ng/mlを再現性よく測定できる、酵素免疫測定法の開発に成功した。今後は、開発した酵素免疫測定法の特異性を確認するために、既に確立されているEAPの特異的な測定法であるHPLC法と本法とのEAP定量性の比較実験を行い、ここまでの成果を論文として報告する予定である。また、キットの開発のため、EAPのモノクローナル抗体の作製も試みる。

Causes of Carryover

当初の計画では、令和元年度中に、HPLC法と本法とのEAP定量性の比較実験を完了する予定であったが、やや遅れたため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額は、HPLC法と本法とのEAP定量性の比較実験で用いる試薬を購入する予定である。