2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of DNA sequencing method targeting on guanine and abasic site
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18K05195
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
呉 純 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (90415646)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アジド - シュタウディンガーライゲーション / クリック反応 / 表面プラズモン共鳴アッセイ / 生物発光アッセイ法 / グアニン基 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グリオギザール化合物はDNAやRNAの４つの塩基のうちグアニン基のN1とN2位の窒素と反応し、５員環状化合物を作ることが古くから知られている。この性質を利用して、アセチレン置換基を有するグリオキザールの化合物を用いてDNA中のグアニン基と反応させてから、末端アセチレン基をアジド化合物によるクリック反応を介してグアニン基のビオチン化に成功していた。しかし、このクリック反応は触媒として遷移金属Cuを必要である。遷移金属CuはDNAのリン酸基に配位することによって、DNA分子は切れやすくなることが考えられることから、Cuフリーの連結反応によるゲノムDNA中のグアニン基へのビオチン化を試みた。その結果、オリゴDNAサンプル中のグアニン塩基を4-アジドフェニルグリオキサール反応で修飾したのちに、遷移金属を必要としないアジド - シュタウディンガーライゲーションを介して一本鎖オリゴDNA中のグアニン基のビオチン化に成功した。つぎに真核生物から抽出・断片化した二本鎖DNAを変性させ、DNA中のグアニン基を上記の二段階反応でビオチン化し、穏やかな条件下でストレプトアビジンによる変性された一本鎖DNAの捕捉が行われた。真核生物のゲノム中の５－ヒドロキシメチルシトシンの検出するため、抗５－ヒドロキシメチルシトシン抗体を用いた表面プラズモン共鳴アッセイやルシフェラーゼと抗体による生物発光アッセイ法から、真核生物由来のゲノムDNAサンプル中に存在する微量５－ヒドロキシメチルシトシンの検出に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子のプロモーター領域にあるCpGアイランドにおけるメチルシトシンの除去は 遺伝子転写の再活性化の役割を果たす。最近、哺乳動物細胞からDNA脱メチル化に関わる酵素が見つかた。メチルシトシンはまず5-ヒドロキシメチルシトシンに変換され、DNAチミングリコシラーゼによって塩基が除去され、グアニンと脱塩基サイトという中間体を経て、シトシンに変わることが明らかになった。本研究は、脱塩基サイトにあるグアニン基をビオチン化し、ストレトアビジンによるグアニンと脱塩基サイトを有る二本鎖DNA断片の精製・濃縮の手法を開発し、次世代シーケンサーによる精製・濃縮されたDNA断片の解析を進める計画である。まず、Cuフリーの連結反応によるゲノムDNA中のグアニン基へのビオチン化を試みた結果、グアニン塩基を4-アジドフェニルグリオキサール反応で修飾したのちに、遷移金属を必要としないアジド - シュタウディンガーライゲーションを介してDNA中のグアニン基のビオチン化に成功した。一方、二本鎖オリゴDNAの脱塩基中のグアニン基が二本鎖内のほかのグアニン基よりもグリオギザール化合物と素早く反応することに着目し、真核生物から抽出・断片化した二本鎖DNAを変性せずに、脱塩基に存在するグアニンのビオチン化を試みた。回収したDNA断片に次世代シーケンサー解析用のアダプターを付加させ、次世代シーケンサーによる解析を進める段階に至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
ゲノムDNA中のグアニンと脱塩基サイトを解析するため、まず、市販のゲノム抽出キットを用いて哺乳動物細胞からゲノムDNAを抽出・断片化し、4-アジドフェニルグリオキサール反応で修飾したのちに、遷移金属を必要としないアジド - シュタウディンガーライゲーションを介してDNA中のグアニン基のビオチン化を行った。次に、精製分離したDNA断片に解析用のアダプターを加え、TaqポリメラーゼによるPCR反応で断片を増幅させた。二本鎖オリゴDNAの脱塩基中のグアニン基がビオチン化されているので、TaqポリメラーゼによるPCR反応は脱塩基に起因する変異を生成することから、ほかの場所のグアニンと区別できる。現在、次世代シーケンサーによるグアニン・脱塩基サイトの解析を進める段階に至った。一方、メチルシトシンの除去はTET1酵素で生成される5-ヒドロキシメチルシトシンからグアニンと脱塩基サイトならびに塩基除去修復機構によって行われる。細胞内のDNAチミングリコシラーゼによる5-ヒドロキシメチルシトシンの除去は律速段階であると考えられている。そこで、組換え体のDNAチミングリコシラーゼを調製して、ゲノムDNA中に残存している5-ヒドロキシメチルシトシンの除去反応ステップを追加し、in vitroでゲノムDNA中にグアニンと脱塩基サイトを作製し、次世代シーケンサーによる解析を予定している。これらの結果との比較ついても検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、本年度の成果を3月に論文で発表したが、論文の別刷りが次年度に届くので、その支払い分を次年度に振り越したからです。研究自体は予定通りで進んでいる。
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