Development of DNA sequencing method targeting on guanine and abasic site

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K05195
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 呉 純 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (90415646)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ５－ヒドロキシメチルシトシン / メチルシトシン / グアニン塩基 / ビオチン / 次世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

本年度、ヒトバーキットリンパ腫瘍細胞から抽出したゲノムDNA中の脱メチル化の中間体である脱塩基・グアニンサイトの解析を行った。脱塩基を有するDNA断片を鋳型とするPCR反応ではアデニン塩基が脱塩基サイトに挿入されるので、グアニン塩基からアデニン塩基への変異配列の検出を試みた。その結果、1番の染色体において20000ヶ所を超える変異配列が検出された。従来、一つの細胞において一日600ヶ所の脱ピリミジン塩基サイトが生成されると予想されていたが、今回の解析からバーキットリンパ腫瘍細胞においてより多くのグアニン・脱塩基サイトが生成されることが強く示唆された。
チミジンDNAグリコシラーゼはT/Gミスマッチ部位を認識し，N-グリコシド結合を切断してチミンを除去する酵素である。一方、哺乳動物細胞由来TDGはグアニン・チミン部位のチミンのほかに、グアニン・5-ヒドロキシメチルシトシンの酸化物である5-フォルミルシトシンや5-カルボキシルシトシンを除去することが報告されている。そこで、チミジンDNAグリコシラーゼの組み換えタンパク質を用いてグアニン・脱塩基サイトを生成する酵素活性の評価を試みた。まず、二本鎖オリゴDNA中のG / Tミスマッチ部位を導入し、チミジンDNAグリコシラーゼで処理した。反応後に、DNAの脱塩基サイトを検出するキットによる反応活性評価を行った。しかし、チミジンDNAグリコシラーゼによる反応活性はみられなかった。現在、反応の条件やアッセイ法の最適化を進めている。