2018 Fiscal Year Research-status Report
難分解性含塩素有機リン化合物を高効率で分解可能な無機リン酸制御解除細菌株の創出
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18K05197
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
阿部 勝正 長岡技術科学大学, 工学研究科, 助教 (40509551)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 環境汚染物質 / 有機リン化合物 / 組換え大腸菌 / 生物分解 / 環境保全 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Tris(2-chloroethyl) phosphate（TCEP）などの塩素を含む有機リン化合物は，可塑剤や難燃材として世界各地で大量に用いられているが，難分解性であり，種々の毒性を有する．研究代表者はこれまで，含塩素有機リン化合物分解システム構築のため， TCEP分解菌 Sphingobium sp. TCM1を単離し，その分解メカニズムについて詳細に解析してきた．それら研究において，TCM1株によるTCEP分解には多大な時間を要すること，さらにその分解酵素は無機リン酸制限下でしか生産されないなど，実環境での使用を困難にする問題を有していることが明らかになった．本研究では研究代表者がこれまで同定に成功したTCEP分解酵素群を大腸菌で構成的に高生産させることで，無機リン酸の有無にかかわらず高機能を発揮する含塩素有機リン化合物分解菌を創出することを目的としている．平成30年度は以下の業績を上げた．
1.大腸菌がホスホジエステラーゼ（PDE），ホスホモノエステラーゼ（PME）の関連酵素を有していることからホスホトリエステラーゼ（HAD）のみを発現させることでTCEPの完全分解が可能となるか解析を行った．しかし，HADのみの発現ではTCEPを完全に分解できないことが明らかとなった．
2.上記1の結果から，HADに続く分解を担うPDEを共発現させた場合の分解挙動について検討した．その結果，本菌はTCM1株を用いた分解より12倍早い8時間程度で50 μMのTCEP完全分解できること，また，50 μM以下のTCEPであれば誘導剤なしで完全分解可能であることを明らかにした．
3.100 μM以上の高いTCEP濃度の場合に関しても検討した結果，培養液への誘導剤添加が必須ではあるが，72時間でTCEPを完全分解しており，本菌は高濃度のTCEP分解にも対応可能であることが示された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腸菌において，ホスホトリエステラーゼ（HAD）とホスホジエステラーゼ（PDE）を発現させることでtris(2-chloroethyl) phosphate（TCEP）の完全分解が可能となることを明らかにした．また，HAD・PDEを共発現させた大腸菌は条件等を詳細に検討しない場合においても50 μM TCEPをSphingobium sp. TCM1株より約12倍早く分解可能である事も同時に明らかとなった．
これらの結果は本研究課題であるTCEP高効率分解菌創出の基盤として非常に重要な結果であり，本研究は概ね順調に進展していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度はTCEPを短時間で分解可能な組換え大腸菌を創出することに成功している．今後についてはTCEP分解酵素発現大腸菌の各酵素遺伝子の最適発現条件について解析すると共に，遺伝子発現に関わる酵素生産調節因子を選抜，使用することで前年度より高機能な含塩素有機リン化合物分解菌を作製する．具体的な内容を以下に示す．
1.TCEP分解酵素発現大腸菌の各酵素遺伝子の最適発現条件の解析
前年度に作製したTCEP分解酵素群発現大腸菌の各酵素遺伝子の最適発現条件（培養温度，誘導剤（IPTG）濃度など）について網羅的に解析する．発現大腸菌は超音波破砕後，各種酵素活性を測定する．活性測定法については既に確立済みであり，ホスホトリエステラーゼ（HAD）活性はGCを用いたTCEP濃度の減少から，ホスホジエステラーゼ（PDE）活性については発色基質を用いた活性測定法で行う．
2. TCEP分解酵素遺伝子の発現に関わる生産調節因子の選抜
大腸菌のゲノムDNA配列は既に明らかにされている．そこで，ゲノムデータベースより構成的発現遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）としてよく知られている，グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターを同定し，同定した遺伝子をpETベクター中のT7プロモーター領域と置き換えるように挿入する．目的ベクターの構築はin-fusionクローニング法で行う．構築されたベクターのプロモーター下流にHAD・PDE遺伝子を挿入し，宿主として用いる大腸菌DH5αに熱ショック法を用いて導入する．上記プロモーターは生育環境に影響せず目的酵素を生産することから，培養培地には大腸菌で最も良く使用されるLB培地を用い，培養後菌体の酵素生産については 1. と同様の活性測定法で評価する．
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| Causes of Carryover |
当該助成金が生じた理由としては，会計上の理由で3月末までの支払いが済んでいない分，及び，前年度の遺伝子・分析試薬の購入が当初予測より少なかったためである．
本年度に関してはプロモーターの改変を含む多くの分子生物学実験を行なう予定である．また，酵素活性測定でガスクロマトグラフィー質量分析計も多く使用する予定であることから，その消耗品費が本年度不足する可能性も考えられる．
以上の事から，当該助成金については本年度請求した助成金と合わせて主に分析関係試薬や遺伝子関連試薬などの消耗品費として使用する予定である．
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