2018 Fiscal Year Research-status Report
支持脂質膜電気泳動法による巨大膜タンパク質調製と高速AFMによる構造動態解析
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18K05311
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
奥野 貴士 山形大学, 理学部, 准教授 (80411031)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 / マイクロ流路 / 細胞膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ヒト培養細胞の膜タンパク質を可溶化等の過程を経ない新しい膜タンパク質の精製システムの開発を目的としている。本年度の主な成果としては、標的タンパク質の一つに選定した膜修復に関与するDysferlinのGFP融合タンパク質を発現した培養細胞の確立することができ、全反射蛍光顕微鏡解析等に適した試料であることも確認できた。いくつかの培養細胞を用いてGFPの蛍光強度を目安に標的タンパク質の発現量を確認したところ、ヒト胎児腎細胞HEK293への発現効率・量が比較的良いことを確認することができた。しかし、細胞膜調製時の緩衝液処理段階で、細胞が剥がれてしまうことがわかり、当研究室で確立してきた細胞膜試料調製方法を改良する必要があった。現在、新しいプロトコルの確立を実施しており、ある程度問題を回避できる方向性を見出すことができ、目標達成に支障はない。
さらに、細胞膜の基板への固定方法を改良することができた。細胞試料表面のゼータ電位が細胞膜の基板固定の重要な因子の一つであることを見出し、固定する基板表面の電化と細胞膜表面の電荷を化学的な修飾によりコントロールし、細胞膜固定の効率を向上させることができた。一方で、実験に使用する細胞試料の量が多量に必要であり、実験全体の進度とコスト面で問題であった。そこで、細胞膜試料の基板上へのマニピュレート→固定→電位泳動までをマイクロ流路中で全て処理できる器具を完成させることができた。当初の計画では、基板に固定した細胞膜と支持脂質膜の融合条件までを計画していたが、細胞膜固定方法の条件検討で時間を費やし、予備実験段階にあり、 2年目においては、中間目標を予定通り達成する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画をしていた標的タンパク質を発現した培養細胞の準備と観察用のマイクロ流路デバイスを完成させることができた。これらの研究進展により、具体的に電場依存的に標的分子の泳動特性を評価できるようになり、概ね順調に進展している。
一方で、細胞膜と基板支持脂質膜の融合条件を見出すには至っていないが、予備実験の段階にある。2年目の研究推進方策を工夫し、また研究体制も改良する。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の実験計画通り、研究を推進する予定である。マイクロ流路が当初よりも早く完成したため、今後研究がよりスムーズに効率的に進められることが期待できる。さらに、マイクロ流と開発に割く研究時間を開発が遅れている、細胞膜と支持脂質膜の融合条件検討の時間に充てることができ、当初の計画通りのスケジュールで研究を推進できる。
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| Causes of Carryover |
物品費については当初の計画通りの使用してきた。旅費についてAFM観察および学会発表を計画していたが、いずれも使用しなかっため、次年度のAFM観察および学会発表等に使用する予定である。
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