Structural dynamics analysis of membrane protein prepared by supported lipid membrane electrophoresis

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K05311
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 奥野 貴士 山形大学, 理学部, 准教授 (80411031)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 膜タンパク質 / GPMVs / 細胞膜

Outline of Annual Research Achievements

細胞膜の機能を司る膜タンパク質の機能/構造解析は、生命科学や創薬研究の推進に欠くことができない重要な位置付けにある。しかし、膜タンパク質の調製には、高い技術と豊富な経験が必要であり、解析に十分な純度と量を得ることが難しく、膜タンパク質研究のボトルネックとなっている。
本研究は、培養細胞から細胞膜をGPMVsとして切り出し、GPMVsからガラス等の基板支持状態の細胞膜（細胞膜シート）を調製し、その基板上の細胞膜から標的の膜タンパク質を電場依存的に泳動し、基板支持脂質膜中で濃縮/精製を検証した。
研究期間においては、細胞膜修復に関与するdysferlinを標的タンパク質の一つとし、蛍光タンパク質を融合したdysferlin（GFP-dysferlin）を発現した培養細胞からの標的タンパク質の調製方法を検討した。その結果、GFP-dysferlinを発現したHeLa細胞を準備し、標的分子を含む細胞膜が基盤上に効率よく固定できるプロコルの確立に成功した。基板上に固定した細胞膜中のGFP-dysferlinが機能保持しているか検証した。Dysferlinを構成する細胞質側に張り出したドメインは、カルシウムイオン依存的に細胞膜表面への親和性が高くなることが予測されていた。Dysferlinのカルシウム依存的なコンフォメーション変化に伴い、脂質膜中の拡散速度が変化すると仮説をたて、FRAP法により検証を行なった。その結果、カルシウム依存的にGFP-dysferlinの拡散速度の低下が確認でき、細胞膜シート中で標的分子が機能を保持していることを明らかにした。さらに、細胞膜シート中の脂質分子およびいくつかの膜タンパク質について、電場依存的に泳動できることを確認した。今後は、基板支持脂質膜への標的分子の泳動条件を確立するべく、研究開発を発展させていく。