2020 Fiscal Year Research-status Report
フェリチンを用いた新規「蛋白質ケージ構造解析法」の技術基盤の確立
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18K05314
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
金丸 周司 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (50376951)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 蛋白質ケージ / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、高い熱安定性・pH安定性を有する蛋白質ケージ（Scaffold）のもつ直径約8nmの内部空洞に標的蛋白質を閉じ込め、粒子画像抽出が容易なScaffoldごとクライオ電顕単粒子解析法によって立体構造を決定すること、そのために必要な技術基盤を構築することを目的としている。
現在までに、モデル分子を用いて発現ベクターの構築から、精製、電顕観察、画像解析までを繰り返し、高分解能構造を得るために必要な技術基盤を１つ１つ精査・開発を行っている状態である。
蛋白質発現に関しては、Scaffold蛋白質と標的蛋白質の発現量をそれぞれのベクターのコピー数をコントロールすることで、適切なScaffold-標的蛋白質複合体を発現させることに成功した。蛋白質精製に関しては、精製タグを6 x his-tagからStrepIIタグに変更することでScaffold-標的蛋白質複合体を分離することに成功した。
標的蛋白質のケージ内固定化に関しては、Scaffoldと標的蛋白質を繋ぐリンカーを種々のαヘリックス形成配列に置換し、標的蛋白質を含まないケージを作成し結晶構造解析にて評価した。ところが、ケージの高い対称性と異なる対称要素を持つため、もしくは期待した硬い構造を形成できないために、いずれの場合もリンカー部分の電子密度を観察できなかった。現在、今まで用いていた蛋白質ケージよりも内部空洞の小さい蛋白質ケージを用いて標的蛋白質の固定化を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
モデル標的蛋白質としてGFPを用いて、発現系の構築・精製条件検討を行った。その結果、
1.Scaffold蛋白質と標的蛋白質の発現量をそれぞれのベクターのコピー数をコントロールすることで、適切なScaffold-GFP複合体を発現させることに成功した。
2.蛋白質タグを付加することで、Scaffold-標的蛋白質複合体のみを単離することを試み、ほぼScaffoldのみの分子種からScaffold-標的蛋白質複合体を分離することが可能となったが、蛋白質タグを付加することでそれぞれの発現量のコントロールが難しくなり、以前に比較して構造解析に適した試料の収量が減少した。そこで、蛋白質タグからStrepIIタグに変更したところ、効率よく試料の調整が可能となった。
3.GFPがScaffoldに対して、複数の向きで配置している問題に関してはGFPの相対配向を固定するために様々なリンカーを試行してきたが、GFPの内部空洞での固定化がうまくいっていない。今まで用いてきたScaffoldより小さい空洞を持つScaffoldを用いて固定化を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
標的蛋白質のScaffold内部への固定化を実現するため、内部空洞の小さいScaffoldを用いて研究を遂行する。
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| Causes of Carryover |
当初計画より進捗状況が遅れているため、最終年度延長を申請した。試料調製に必要な消耗品ならびに論文投稿出版料に使用予定である。
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[Journal Article] A conserved Ctp1/CtIP C-terminal peptide stimulates Mre11 endonuclease activity2021
Author(s)
Zdravkovic, A.; Daley, J. M.; Dutta, A.; Niwa, T.; Murayama, Y.; Kanamaru, S.; Ito, K.; Maki, T.; Argunhan, B.; Takahashi, M.; Tsubouchi, H.; Sung, P.; Iwasaki, H.
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences
Volume: 118
Pages: 1-7
DOI
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