2019 Fiscal Year Research-status Report
ターンオン蛍光を伴う部位特異的リジン修飾、クロスリンク形成と蛋白質研究への応用
| Project/Area Number |
18K05319
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
麻生 真理子 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (30201891)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 蛋白質修飾 / 蛍光 / リジン残基 / 環境応答型蛍光 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
研究課題、ターンオン蛍光を伴う部位特異的リジン修飾、クロスリンク形成と蛋白質研究への応用を進めるため、１）環境応答型蛍光基を用いた蛋白質修飾と相互作用検出。２）蛍光を伴うクロスリンク形成反応の開発、３）物性を改良した蛍光分子の開発について検討を行った。１）では、前年度行った大腸菌DNA複製開始蛋白質DnaAの部位特異的リジン残基蛍光修飾における修飾部位決定のため、解析が容易なDnaAのDNA結合ドメイン（以下ドメイン４）を用いて、酵素消化を行った。結果として得られる蛍光を持つ消化ペプチドの収率が低く、決定には至っていない。この原因として蛋白質修飾効率に着目し種々検討した結果、蛍光修飾効率改善に成功した。酵素消化反応についても効率化を目指し、条件検討を行った。新たな条件で得た蛍光修飾蛋白質を用いて修飾部位の決定を検討中である。また修飾が予想されるリジン残基をアラニンに置換した変異体を共同研究者の協力により調整した。蛍光修飾の進行を調べ、上記実験と並行してリジン残基部位特異的修飾を評価する。蛋白質の相互作用検出も引き続き検討する。２）では、従来のリジン蛍光修飾分子にクロスリンク形成のためのリンカー部を導入した分子の合成を検討した。リンカーとしてヒドロキシメチル基の導入に成功し、リジン修飾分子への変換を現在おこなっている。また３）では蛍光修飾反応の加速、蛍光分子の安定性向上を目指し、従来の分子に置換基を導入したリジン蛍光修飾分子を設計し、合成を検討した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度までの研究では蛋白質蛍光修飾は蛍光スペクトル測定によりモニターして良好な結果を得たと考えていた。その後、修飾蛋白質の酵素消化による修飾部位決定を試みたが、蛍光ペプチドの生成効率が低く修飾部位決定には至らなかった。これらの問題点を解決するため、蛍光修飾反応の効率改善、酵素消化反応の条件検討を行った。この結果、蛋白質蛍光修飾効率が改善できた。酵素消化反応の時間短縮、効率化の可能性も示唆された。これらの改善に基づき、修飾部位の決定を現在検討している。また修飾部位と予想するリジン残基をアラニンに置換した変異体を用いて、蛍光修飾の有無を調べ、修飾反応を評価する実験も可能となった。
２）光を伴うクロスリンク形成反応の開発、３）物性を改良した蛍光分子については新規分子の化学合成を計画に従って進めており、完成に向かっている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究の完成を目指して計画に基づいて以下の研究を進める。
１）について。従来より効率よく蛍光修飾したドメイン４を用いて、酵素消化による修飾部位の決定、また蛋白質相互作用の蛍光によるモニターを検討する。またアラニン変異体を用いた比較実験も行う。
２）クロスリンク可能なリジン修飾分子を完成する。これを用いてDNA-蛋白質、蛋白質―蛋白質のクロスリンクの検討を行う。
３）反応加速を期待した新たなリジン蛍光修飾分子を合成し、その反応性を検討する。
|
| Causes of Carryover |
反応性核酸調整に必要なモノクロ光源の購入を計画していたが、ＬＥＤ方式照射ランプも安価に入手できる可能性があり、性能の比較などに時間がかかり、年度内の購入を行うことができなかった。また当初購入を計画していたダイヤフラム型真空ポンプは別予算で購入したため、今回の次年度使用額となった。翌年度分予算と合わせて、研究遂行のため必要な老朽化した物品の更新、照射ランプの購入など有効に使用する。
|
