2020 Fiscal Year Research-status Report
ターンオン蛍光を伴う部位特異的リジン修飾、クロスリンク形成と蛋白質研究への応用
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18K05319
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
麻生 真理子 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (30201891)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 反応性核酸 / リジン修飾 / 環境応答型蛍光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ターンオン蛍光を伴う部位特異的リジン修飾、クロスリンク形成と蛋白質研究への応用を進めるため、１）環境応答型蛍光基を用いた蛋白質修飾と相互作用検出、２）蛍光を伴うクロスリンク形成反応の開発、３）物性を改良した蛍光分子の開発について検討を行った。１）では、前年度までの研究で大腸菌DNA複製開始蛋白質DnaAのDNA結合領域に結合する配列を持つリジン修飾反応性核酸を用いて、リジン残基を環境応答型蛍光基により修飾することを確認したが、得られた修飾蛋白質の相互作用や構造変化を蛍光の変化で検出できるかを調べた。反応性核酸との反応により修飾蛋白質が生成すると蛍光強度は増加した。ほぼ修飾反応が終了した反応液に過剰量の未修飾蛋白質を加えると、蛍光強度は更に増加した。修飾反応後反応性核酸と結合状態の修飾蛋白質から過剰量の未修飾蛋白質の添加により反応性核酸が遊離したことで蛍光強度が変化した可能性が示唆された。この結果を精査するため、修飾蛋白質の精製、単離法を検討した。精製した修飾蛋白質を用いてDNA結合による蛍光強度変化を精査する予定である。２）では、前年度、従来のリジン蛍光修飾分子にクロスリンク形成のためのリンカー部を導入した分子の合成を行っていたが、完成に近づいた。収率向上が必要な段階の検討、合成の完了、リジン修飾を検討する。また３）では従来型より安定性が向上した蛍光分子の合成に成功した。蛍光修飾反応の加速についてさらに検討を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナウイルス感染症拡大防止のため、研究室活動が制限され、研究代表者、研究協力者2名の活動が困難な時期があったため、やや遅れているが確実に進展している。１）について。DnaAのDNA結合ドメインを用いて、反応性核酸に近接するリジン残基を環境応答型蛍光基により修飾し、得られた修飾蛋白質がDNAとの結合により蛍光強度が変化することを示唆するデータを得た。この結果を精査するため、修飾蛋白質の精製が必要と考え、少量の蛋白質を緩和な条件で安定に効率よく精製する方法を検討した。未修飾蛋白質を用いて、イオン交換、蛋白質のHis-tagの親和性の利用した精製法を検討し、His-tag親和性を利用した精製を採用することとした。今後修飾蛋白質を精製し、DNAとの相互作用が蛍光変化により検出できるかを精査する準備ができた。２）リジン蛍光修飾分子にクロスリンク形成のためのリンカー部を導入した分子の合成は完成に近づいたので、合成を完了し、リジン修飾反応を検討する。また安定性を向上した環境応答型分子を得、これが従来分子と同様、リジン修飾により得られることを確認した。さらに新規分子の合成を行ったので、今後、評価、反応性検討を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究を構成する3つの項目の完成に向かって以下の計画で研究を遂行する。
１）について少量の未修飾蛋白質の精製に有効であったHis-tagの親和性を利用した緩和な精製法を用いて、修飾蛋白質の精製を行い、これを用いてDNAとの結合による蛍光強度の変化を精査する。また酵素消化による蛋白質修飾部位の決定も行う。２）について、リンカー部をもつリジン修飾分子の合成を完成し、リジン修飾反応を検討する。蛋白質―DNAクロスリンク形成反応に応用する。３）合成に成功した安定性を向上した蛍光分子によるリジン修飾の評価、新たに合成したリジン修飾分子の物性の検討、リジン修飾反応の評価を行う。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染拡大防止のため、研究代表者、協力者の研究活動が制限され、当初計画が遅延したため補助事業期間の延長を申請した。当初予定していた研究計画を次年度を行う。
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