2019 Fiscal Year Research-status Report
キラルフリーなホタル生物発光を実現する細胞株の作製とバイオイメージングへの展開
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18K05320
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
加藤 太一郎 鹿児島大学, 理工学域理学系, 助教 (60423901)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ホタル生物発光 / ホタルルシフェラーゼ / チオエステラーゼ / 立体反転 / デラセミ化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、基質のラセミ化を気にすることなく、発光追跡期間が長期間にわたる場合でも定量的かつ再現性の高い測定が可能なホタル生物発光バイオイメージングシステムを構築することである。
ホタル生物発光バイオイメージングは、発光基質D-ルシフェリンを血中投与するだけでほぼ全身に行きわたらせることが可能という手軽さがある一方、生体内で基質が簡単にラセミ化してしまうため、イメージング測定時のルシフェリンの光学純度維持が困難となり、発光の定量性や再現性が担保されないという問題がある。そこで申請者は、ホタル生物発光イメージングにおいて、基質のラセミ化を気にすることなく信頼性の高い発光測定が可能なシステムの構築を目的とした研究を計画した。目標達成のために外来性チオエステラーゼ遺伝子を導入し、標的細胞内に、ホタル体内におけるD-ルシフェリン合成経路を模倣したデラセミ化反応経路を再現することを目指す。
前年度の検討で、ヒト細胞の内在性チオエステラーゼの一つが、L-ルシフェリル-CoA体を非常に高い立体選択性にて特異的に加水分解を行い、デラセミ化反応を阻害していることを明らかにした。そこで令和元年度は、デラセミ化反応に悪影響を与えている可能性が高いチオエステラーゼ(ACOT13)遺伝子をRNAi技術によってノックダウンした細胞株を作製した。検討には、ヒトがん細胞(Hela株)由来のホタルルシフェラーゼ恒常発現細胞株を利用した。その結果、細胞の外見上は全く変化がなかったが、L-ルシフェリンを用いた発光強度は、ノックダウンしていない株、あるいはネガティブコントロール株と比較して、明らかに低下することが確認された。これは、細胞内でL-ルシフェリンのチオエステル化が進行するものの、加水分解されないために細胞内ルシフェリン濃度が低下したためであると考えられ、ノックダウンの効果を確かめることが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
年度計画の通り、デラセミ化反応の進行を阻害する可能性の高いチオエステラーゼ遺伝子をノックダウンしたヒトがん細胞由来のホタルルシフェラーゼ恒常発現細胞株を作成し、その細胞株のルシフェリンに対する発光活性機能を確認することが出来たため。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の検討でデラセミ化反応に悪影響を与えている可能性が高いチオエステラーゼ(ACOT13)遺伝子をRNAi技術によってノックダウンすることで、細胞株のL-ルシフェリンを用いた発光強度は明らかに低下することが分かった。これは、細胞内でL-ルシフェリンのチオエステル化が進行するものの、加水分解されないために細胞内ルシフェリン濃度が低下したためであると考えられる。そこで今年度は、ACOT13をノックダウンした細胞中でD-ルシフェリル-CoAを加水分解可能な大腸菌等由来のチオエステラーゼを一過性発現させデラセミ化経路を構築する。これによって本研究の目的である基質のラセミ化を気にすることなく信頼性の高い発光測定が可能なシステムを実現することを目指す。
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| Causes of Carryover |
研究1年目に実施予定であったヒト細胞培養に対するノックダウン実験を進めることができず、それらの経費を昨年度に繰り越しました。平成31年度は計画通り実験を実施しましたが1年目より繰越した経費すべてを利用することはできませんでした。最終年度に培養細胞を利用した実験を継続する予定であり、その実験に経費残を利用する予定です。
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