2020 Fiscal Year Annual Research Report
Creation of cell lines that realize chiral-free firefly bioimaging
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18K05320
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
加藤 太一郎 鹿児島大学, 理工学域理学系, 助教 (60423901)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ホタル生物発光 / ホタルルシフェラーゼ / チオエステラーゼ / 立体反転 / デラセミ化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、基質のラセミ化を気にすることなく、発光追跡期間が長期間にわたる場合でも定量的かつ再現性の高い測定が可能なホタル生物発光バイオイメージングシステムを構築することである。
ホタル生物発光バイオイメージングは、発光基質D-ルシフェリンを血中投与するだけでほぼ全身に行きわたらせることが可能という手軽さがある一方、生体内で基質が簡単にラセミ化してしまうため、イメージング時のルシフェリンの光学純度維持が困難という問題がある。そこで申請者は、ホタル生物発光イメージングにおいて、基質のラセミ化を気にする必要がない発光測定が可能なシステムの構築を目指した。目標達成のために外来性チオエステラーゼ遺伝子を導入し、標的細胞内に、ホタル体内におけるD-ルシフェリン合成経路を模倣したデラセミ化反応経路を再現することを計画した。
平成30年度は、ヒト細胞の内在性チオエステラーゼの一つが、L-ルシフェリル-CoA体を非常に高い立体選択性にて特異的に加水分解を行い、デラセミ化反応を阻害していることを明らかにした。令和元年度は、ヒトがん細胞(Hela株)由来のホタルルシフェラーゼ恒常発現細胞株を利用して、デラセミ化反応に悪影響を与えている可能性が高いチオエステラーゼ(ACOT13)遺伝子をRNAi技術によってノックダウンした細胞株を作製した。令和2年度は大腸菌由来のチオエステラーゼ(TESB)を染色体上にランダムに挿入したHela株由来のホタルルシフェラーゼ恒常発現細胞株ライブラリーを作成した。また得られた細胞株のいくつかについてACOT13遺伝子をRNAi技術によってノックダウンすることで、本課題の目標であるデラセミ化反応経路をHela細胞内に再現した。また、ルシフェリンの光学活性体の違いによる発光特性を比較することでL-体でも発光する細胞に関する情報を得た。
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