2018 Fiscal Year Research-status Report

Studies on the functional role of unpaired regions of nucleic acid structures and their effects of molecular crowding

Research Project

Project/Area Number	18K05325
Research Institution	Konan University
Principal Investigator	中野修一甲南大学, フロンティアサイエンス学部, 教授 (70340908)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	DNA非標準構造 / DNAループ / 熱安定性 / 生体ポリアミン / ジアミン化合物
Outline of Annual Research Achievements	細胞内部の分子環境が核酸の非構造部位に与える影響を解明するために、本年度はDNAの典型的な二次構造であるインターナルループ構造への影響を検討した。オリゴヌクレオチドを用いて様々な大きさのループ部位（最大20ヌクレオチド）を含むDNA二重鎖を作製し、それぞれの構造体の熱安定性を測定した。データ解析の結果、構造安定性はループが大きくなるほど低下し、非構造部位の存在は二重鎖構造の形成を妨げることが確認された。次に、細胞内部の分子環境として、核に多く含まれるポリアミン（生体ポリアミン）共存下におけるDNA構造の安定性を測定した。生体ポリアミンの電荷とサイズによる影響を調べるために、様々な種類の生体ポリアミンとともに、生体ポリアミンと構造が類似したジアミン化合物を検討した。生体ポリアミンはDNAの凝集や沈殿を生じさせることが知られているが、本研究で用いたオリゴヌクレオチドではそのような問題は生じなかった。DNA構造の安定性を測定したところ、生体ポリアミンとジアミン化合物はDNA二重鎖構造を安定化させ、とくにループ部位を有する構造体に対して大きな安定化効果を示すことが明らかになった。興味深いことに、ループが大きくなるほど安定化効果が顕著になり、非構造部位によってもたらされるDNA構造の不安定化効果が大きく低減されることが見出された。生体ポリアミンとジアミン化合物がループ部位に静電的に結合することで、DNAの非標準構造が安定化したものと考えられる。また、これらのカチオン性分子はループ構造を大きく変化させず、カチオン性分子の結合はDNA構造を大きく変えないことも示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 核酸の典型的な二次構造であるインターナルループ構造を設計し、熱安定性の測定とデータ解析を進めた。この検討によって、ループ部位を含むDNA構造が生体ポリアミンやジアミン化合物によって大きく安定化することが見出された。生体ポリアミンがDNA二重鎖を安定化させることはすでに知られていたが、非塩基対部位を含む構造体に対する安定化効果の方が顕著であり、この知見は、細胞の核に大量に含まれる生体ポリアミンが非塩基対部位を含むDNA非標準構造の形成に大きな影響を及ぼしていることを示唆している。さらに、カチオン性分子の作用メカニズムに関する知見を得るために、電荷間距離や分子サイズが異なる様々な種類の生体ポリアミンとジアミン化合物による影響を比較した。また、グアニンの連続配列が形成する四重鎖構造の熱安定性についても検討を始め、ループ部位が四重鎖構造の形成に与える影響に関する知見が得られつつある。今年度の結果から、生体ポリアミンの非構造部位への結合がDNA非標準構造の形成を促していることが示唆された。柔軟性を有するDNAのループ部位は生体ポリアミンやジアミン化合物との結合に適していると考えられ、今後の研究に役立つデータを得ることができた。
Strategy for Future Research Activity	生体ポリアミンやジアミン化合物がDNAループ構造に与える影響を熱力学データを用いて調べ、DNAの非標準構造を安定化させるメカニズムを解明する取り組みを継続して行う。非構造部位の大きさによって溶媒への露出度と構造の柔軟性が変化するので、この視点からの考察も行う予定である。さらに、老化やガン化に関わるDNA四重鎖構造に対しても検討を進める。四重鎖のループの長さや位置を変えた構造体を用いるとともに、DNA鎖の配向の影響にも着目する。四重鎖構造に対しては、グアニン塩基のカルテット面とリン酸負電荷への結合を区別するために、金属イオンと競合しないカチオン性分子の使用も試みる。この実験系を構築する試みは今年度に実施したが、構造安定性が低くなりすぎたため、金属イオン滴定実験による評価が困難であった。今後は測定条件を精査して、実験系の構築を試みる。また、生体ポリアミンやジアミン化合物以外のカチオン性分子についても検討を行い、細胞内部の分子環境が核酸の非構造部位の形成に与える影響を明らかにしていく。 DNAの非構造部位のループ部位は柔軟性を有しており、溶媒に露出していることから、分子クラウディング環境の影響を大きく受けると予想される。そこで、核酸の非構造部位に対する分子クラウディング効果を解明するために、ポリエチレングリコール等のクラウディング剤を用いた検討を開始する。分子クラウディング環境においてループ部位を含む二重鎖や四重鎖構造がどのくらい安定に存在できるのかを調べ、非構造部位が果たす役割を解明する。
Causes of Carryover	今年度に実施した実験において、生体ポリアミンがDNA非標準構造の安定性に大きな影響を与えることが明らかになった。この影響が予想以上に大きかったため、今年度は生体ポリアミンの作用を調べることを優先し、そのメカニズムを解明するための実験（熱力学的パラメータの算出、ジアミン化合物を用いた検討、ループ構造の評価など）を進めた。これに伴って、大量の試薬の購入を予定していた分子クラウディング効果の検討が後回しになり、消耗品の購入に充てる予定であった予算に残余が発生した。分子クラウディング効果は次年度以降に検討を行い、その際に当初の計画通りの消耗品を購入する予定である。