2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the construction mechanism of porphyrin ring essential for organisms: Formation and cyclization of tetrapyrrole
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18K05326
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
佐藤 秀明 久留米大学, 医学部, 准教授 (60271996)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉島 正一 久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
塚口 舞 (古澤舞) 久留米大学, 医学部, 助教 (40624094)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヘム生合成 / ポルフィリン生合成 / 結晶構造解析 / 酵素反応機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヘム生合成経路は，動物では8つの酵素が進める不可欠な代謝経路である。この経路の前半におけるポルフィリン環の構築に対する理解を深めるため，特にヒドロキシメチルビランシンターゼ（HMBS）の酵素反応メカニズムについて構造生物学的手法により検討した。
HMBSはジピロメタン補因子をもち，4分子のポルホビリノーゲン（PBG）を縮合して1分子のHMBを生成する酵素である。このHMBSに基質を加え，補因子に基質を2分子あるいは3分子だけ連結した反応中間体（ES2およびES3中間体）を調製して，これらのX線結晶構造解析を行った。また，ES2中間体と基質誘導体との複合体を作成し，その構造解析も行った。
ES2中間体については，それ単独と基質誘導体との複合体の両方で結晶構造を明らかにすることができた。得られた解析結果から，少なくとも3番目の基質分子はHMBSのドメイン間でオリゴピロール鎖の末端近傍に結合して，縮合反応が進行することが明らかとなった。
一方，ES3中間体については，同様の結晶化と構造解析に取り組んだものの，得られた立体構造は予想に反してES2中間体のものであった。結晶化前の溶液試料の質量分析ではES3中間体が確認できたことから，オリゴピロール鎖の末端ピロールの結晶中での揺らぎ，または結晶化過程における末端ピロールの解離が原因と推測される。
今後，補因子に基質を1分子あるいは4分子だけ連結した反応中間体（ES1およびES4中間体）の構造解析に取り組み，HMBSのより詳細な反応機構について明らかにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度はHMBSのES2およびES3中間体について，基質類似体との複合体も含めた結晶化と構造解析に取り組んだ。基質類似体との複合体も含めて，ES2中間体について得られた結果は納得のいくものであった。しかし，ES3中間体の解析で得られた結晶構造は，期待に反してES2中間体のものであった。そのため，追加で行った液体カラムクロマトグラフィーや質量分析によるES3中間体の安定性の確認実験に手間取ってしまい，予定通りの進捗とはならなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）HMBSによるPBG 4分子からHMB 1分子への縮合過程の解明：今後，補因子に基質を1分子あるいは4分子だけ連結した反応中間体（ES1およびES4中間体），またそれらの基質類似体との複合体について構造解析に取り組む。これまでに得られたホロ型およびES2中間体，またそれぞれと基質類似体との複合体の構造と合わせて，HMBSの詳細な反応機構について考察する。
（２）UROSによるHMBのD環反転を伴う環化過程の解明：UROSの基質結合様式を解明するため，反応の進行しない基質HMBの類似体を，PBG類似体を共存させたHMBS酵素反応あるいは化学合成で調製し，UROS-基質類似体複合体の結晶構造を解析する。得られる立体構造から基質結合に関わるアミノ酸残基を同定し，HMBの環化に必要と考えられるH+供与体となるアミノ酸残基を予測する。また，基質との相互作用が想定されるアミノ酸残基について変異酵素を作成し，その活性およびKmとkcatの測定から各アミノ酸残基が果たす役割を検討する。これらの実験によりUROSが溶液中で機能する際の基質の結合状態と，反応に必要なH+供与体を決定し，UROSによるD環ピロール反転機構の詳細を明らかにする。
さらに，HMBの環化過程では，HMBの非酵素的環化を抑えるために両酵素が複合体を形成して反応を進める可能性がある。そこで，両酵素の相互作用についてバイオレイヤー干渉法を用いて検討する。また，両酵素の混合物を縮合させた後に断片化して質量分析することで，酵素間の相互作用部位を解析する。さらに両酵素の複合体の結晶構造解析を行い，両酵素間でのHMBの受け渡し機構について解明する。これらの実験の結果に基づいて，HMBの生成と環化の詳細な反応メカニズムについて明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
HMBSの反応中間体の結晶構造解析が予定通りに進まず，またES3中間体の安定性について液体カラムクロマトグラフィーや質量分析による確認が追加で必要になったことなどから，研究の進捗がやや遅れた。それに伴って，構造解析のための測定実験や学会での成果発表の回数が見込みよりも少なくなったため，次年度使用額が生じた。
この次年度使用額は当該年度以降分の助成金と合わせて，試薬や器具などの消耗品費，測定実験や学会参加の旅費，学会や論文での成果発表などに使用する予定である。
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