2019 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the construction mechanism of porphyrin ring essential for organisms: Formation and cyclization of tetrapyrrole
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18K05326
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
佐藤 秀明 久留米大学, 医学部, 准教授 (60271996)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉島 正一 久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
塚口 舞 (古澤舞) 久留米大学, 医学部, 助教 (40624094)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ポルフィリン生合成 / ヘム生合成 / 結晶構造解析 / 酵素反応機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
動物において必須なヘムは８段階の酵素反応により合成される。この経路前半におけるポルフィリン環の構築メカニズムについて理解を深めるため，ヒドロキシメチルビランシンターゼ（HMBS）の反応機構について構造生物学的手法により検討した。ヘム生合成経路の第３段階で働くHMBSは活性部位にジピロメタン補因子をもち，４分子のポルホビリノーゲン（PBG）を順次縮合してヒドロキシメチルビラン（HMB）を合成する。
これまでに我々は，HMBSに基質を加えてカラムクロマトグラフィーで精製すると，補因子に基質が１~４分子だけ連結した反応中間体を分取できることを示した。そして２または３分子の基質を連結した反応中間体（ES2とES3）を調製し，これらの結晶構造解析を実施した。またホロ型またはES2と基質誘導体との複合体を作成し，それらの構造解析も行った。ホロ型とES2で判明した，それぞれの単独と基質誘導体との複合体の両方の構造から，HMBS反応の分子機構は次のように推察できる。まず補因子近傍に基質が結合し，補因子と基質のピロール環が架橋された後，ピロール鎖がピロール１単位分だけ活性部位の奥側にずれる。次に別の基質分子がピロール鎖末端の近傍に結合し，架橋以降の過程を繰り返してヘキサピロール鎖まで伸長する。最後にこれの加水分解でHMBが解離する。こうしてHMB合成は単一の活性部位での縮合反応の繰り返しで進むと考えられる。
一方でES3の結晶化と構造解析にも取り組んできたが，これまでのところES2の構造のみが観察されている。少なくとも結晶化前の溶液試料の質量分析ではES3の存在が確認できたことから，結晶化途中での末端ピロールの解離もしくは結晶中でのピロール鎖末端の揺らぎが原因と思われる。今後，補因子に基質を１または４分子だけ連結した反応中間体の構造も解明して，HMBSの反応機構の全貌を明らかにしたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度もHMBSの反応中間体について，基質類似体との複合体も含めた結晶化と構造解析に取り組んだ。しかし，SPring-8でのＸ線結晶構造解析に適した酵素反応中間体の結晶を思い通りに作成することが困難であったため，予定通りの進捗とはなっていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
次のような実験を進めて，引き続きテトラピロールの生成と環化の詳細な反応メカニズムについて解明を目指す。
【HMBSによるPBG 4分子からHMB 1分子への縮合過程の解明】 補因子に基質を1, 3あるいは4分子だけ連結した反応中間体（ES1, ES3およびES4），またそれらと基質類似体との複合体についてX線結晶構造解析に取り組む。これまでに得られたホロ型酵素およびES2，またそれぞれと基質類似体との複合体の構造と合わせて，HMBSの詳細な反応機構について考察する。
【ウロポルフィルノーゲンIIIシンターゼ（UROS）によるHMBのD環反転を伴う環化過程の解明】 PBG類似体を共存させたHMBS酵素反応あるいは化学合成でHMB類似体を調製する。これを用いてUROS-HMB類似体複合体の結晶構造を解析し，UROSの基質結合様式を明らかにする。また，得られる立体構造から基質結合に関わるアミノ酸残基や，HMBの環化に必要と考えられるプロトン供与体となるアミノ酸残基を予測する。そのようなアミノ酸残基について変異酵素を作成し，その活性測定から各アミノ酸残基が果たす役割を検討する。これらの実験によりUROSが溶液中で機能する際の基質の結合状態と，反応に必要なプロトン供与体を決定し，UROSによるD環ピロール反転機構の詳細を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
酵素反応中間体について構造解析に必要な結晶の作成が難航したため，SPring-8でのＸ線回折実験ができなかった。また新型コロナウイルス感染症の感染拡大防止に伴って，参加を予定していた学会の現地での開催がキャンセルされた。このようなことから，構造解析のための測定実験や学会参加の回数が見込みよりも少なくなったため，次年度使用額が生じた。
この次年度使用額は当該年度以降分の助成金と合わせて，器具や試薬などの消耗品費，測定実験や学会参加の旅費，論文や学会での成果発表の経費として使用する予定である。
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