2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K05328
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| Research Institution | Institute of Systems, Information Technologies and Nanotechnologies |
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Principal Investigator |
宇田 泰三 公益財団法人九州先端科学技術研究所, マテリアルズ・オープン・ラボ, 特別研究員 (20232837)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田口 博明 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 教授 (20549068)
一二三 恵美 大分大学, 全学研究推進機構, 教授 (90254606)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | スーパー抗体酵素 / beta-amyloid / Tauタンパク質 / 認知症 / scFv様分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、認知症の２大原因物質としてbeta-amyloidおよびTauタンパク質が知られている中で、この両物質を標的として、両者を同時に分解しようとするのが目的である。このために最終的に「２機能型スーパー抗体酵素」を作製する事を順次進めて行く。具体的には当初の研究計画に記したように、化学的合成法、および/または、遺伝子工学的合成法を採り入れて、beta-amyloidに対する抗体酵素とTauタンパク質に対する抗体酵素をそれぞれ作製し、両者をリンカーで繋ぎ併せて、ひとつの分子として合成し、初期の目的を達成するものである。
H30年度は初年度であり、主としてTauタンパク質に対する抗体酵素の作製・改良を行い、ついで、beta-amyloidを分解する抗体酵素と遺伝子工学的手法でリンカーを挟んでscFv様分子の合成を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
beta-eta-amyloidに対する抗体酵素研究についてはこれまで幾種類かのクローンを見出しており、研究は進んできている。一方、Tauタンパク質を分解する抗体酵素については、まだ、見出している抗体酵素クローンの数が少なく、１）その性質の解明、を掘り下げなければならない。これと併行してbeta-amyloidを分解する抗体酵素およびTauタンパク質を分解する抗体酵素の両抗体酵素を遺伝子工学的に結び付けて２機能型として機能するべく、２）分子設計と合成に取り組んでいる。
１）Tauタンパク質を分解する抗体酵素:
Tauタンパク質は約440のアミノ酸を有するタンパク質であるが、そのアミノ酸配列の中には特徴的な領域がいくつか存在する。本研究では、２つの配列、C末側(391-408番目: Tau-C peptide)およびN末側(19-30番目: Tau-N peptide)に着目し、それぞれをFRET化してスクリーニングを行い、その中から活性のあるものについて性質を解明した。その結果、Tau-C peptideについては、抗体酵素C1 & C2を見出した。C1はVal399-Ser400間を、C2はGly401-Asp492間を切断し，両クローンで切断部位が異なっていた。一方、Tau-N peptideについては、98種類の軽鎖クローンについてスクリーニングを実施したところ、強く分解するクローンが１種類(N1)見つかった。その切断サイトはAsp22-Arg30間であった。
２）beta--amyloid およびTauタンパク質を同時に分解する２機能型スーパー抗体酵素:
両者の遺伝子および等電点解析からこれまでに見出された抗体酵素の中から最適と思われるクローンの遺伝子を選び出し、両遺伝子を長さ45 baseのリンカーで結んだscFv様分子の合成(全長のサイズは740 base)を終えたところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) beta-amyloidに対する抗体酵素の動力学的解析と性能の改良：２機能型スーパー抗体酵素のより効率的な展開を目指して、現在見出しているbeta-amyloidに対する抗体酵素の性質を深く掘り下げて性能を解明する。特にkcatとKmの値は性能評価に必須である。このデータを基に、より性能を高める方向で研究を進める。
2) Tauタンパク質に対する抗体酵素の動力学的解析と性能の改良：今年度、上述したようにTauタンパク質を分解する抗体酵素について同タンパクの異なる部分を切断する複数のクローン見つかり、大きな進展があった。次には、これらのクローンがどの様な性質を持っているかを詳細に解析する。
3) beta-amyloidに対する抗体酵素およびTauタンパク質に対する抗体酵素のそれぞれの分解活性のデータ取得：２機能型スーパー抗体酵素の性能を正しく判断するためには、各抗体酵素が単独でどの程度の、beta-amyloidおよびTauタンパクを分解するかの基礎的データが必要になる。H31年度はこのデータ採取をおこなう。
4) ２機能型スーパー抗体酵素の発現、精製、性能評価、再設計：H30年度に設計・作製したscFv様の２機能型スーパー抗体酵素を発現ベクターへの組み換え、大腸菌の形質転換、培養、精製、性能評価を実施して行く。これを基に必要ならばさらに性能の高いscFv様分子の再設計に取りかかる。
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| Causes of Carryover |
差額の金額35,184円では、バイオ試薬（抗体関係）が購入できないので、次年度分に組み込んで，購入する事とした。
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Research Products
(3 results)
