2018 Fiscal Year Research-status Report
Study on synthetic glycans complexed with glycosidase foe NMR analysis of the active site
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18K05345
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (70342748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
張 恵平 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 研究員 (10462706)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 生体分子 / 糖鎖 / 有機合成化学 / 構造解析 / NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度の検討において、注目しているアラビナン分解酵素の基質オリゴアラビのフラノシド誘導体の調製、合成したオリゴ糖誘導体の構造解析、およびオリゴ糖誘導体を基質として用いた分解酵素による分解物の解析をおこなった。本年度は直鎖、分岐構造を有するオリゴα-L－アラビノフラノシドを、既に開発済みのフラグメント宿合法を利用した手法により立体選択的かつ効率的に調製した。プローブの還元末端には質量分析においてタグとなるアセトニド基を導入している。そのため、NMR解析においても分岐構造に加え両末端残基は容易に帰属可能であったが、予想した通り、直鎖オリゴα-L－アラビノフラノシドの内部構造の区別は困難であることが明らかとなった。さらにエンド型アラビナン分解酵素切断結果より切断部位を解析し考察したところ、酵素の基質特異性に関する知見を得ると同時に、切断メカニズムについての推測ができた。また、糖鎖合成を簡便に行うために、反応条件によって立体選択性をスイッチできる官能基を導入した保護基を有する糖供与体の開発に成功した。
また高磁場NMRを利用したSTD法を鍵手法として糖鎖リガンド側のピーク分解能を最大限にあげた構造解析を行うこと計画しており、まずアルブミンを用いたモデル系にて、代表的な２糖のスクロースとの結合を検証した。アルブミンに特異的に結合するトリプトファンのSTDは観測されたのに対し、非結合性のスクロース存在下ではタンパク質表面への非特異的結合由来の優位なシグナルは確認されず、リガンドシグナルのみが観測される系であることを確認できた。今後、確立したSTD実験系を用いて、既知のendo 型オリゴ糖加水分解酵素と結合性の糖受容体基質等との組み合わせで結合部位解析の検討へ展開する。還元末端N-アセチルグルコサミンのL－フコシル化体の調製は完了済みで、L－フコシル化の影響についても検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度は、化合物の調整検討や測定条件の設定検討がメインとなり、及び、予定していた分子モデリングによる分子解析は計算機の故障により進んでおらず、別手段を考えざるを得ない状況であるが、懸案であるリガンド分子の調製は進んでいる状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
主に高磁場NMRを相互作用・結合－切断位置解析に利用したいと考えているが、結合が強すぎる場合等は、STD 法ではシグナルが観測されない場合があり、結合しないプローブとの差を判断できない場合がある。その場合１次元NMRでの滴定やITC等で結合を確認し、特異的な結合を区別して観測したいと考えており、詳細を検討していく。このアラビナン分解酵素の構造解析は進んでおらず、結合位置に関する知見はまだ得られていないので、活性中心を含むアラビナン結合サイトは未確定である。野生型酵素及び推定している触媒残基及び結合に関与する残基の変異体との結合について、糖側の結合情報を得たいと考えている。そのためのプローブ合成を引き続き行って行く計画である。さらに結合に重要な位置以外の近傍での化学修飾により、アフィニティータグ等を導入したプローブの調製、共有結合形成、質量分析による位置解析、分子モデリングでの結合サイトの検証を進めたいと考えている。
分析・測定に関しては、確立したSTD実験系を用いて、糖分子や既に研究代表者が合成を達成しているヒト由来糖タンパク質糖鎖フラグメントと関連タンパク質の相互作用などを例に検討すると共に、T1緩和の影響を抑えた反転回転実験から得られるDIRECTION法によるリガンドエピトープマッピングへのアプローチや15N-HSQCによる化学シフト摂動値マッピングなどによるタンパク質の結合部位の解明についての検討を計画している。
本年度の進行具合によっては、連携研究者より調達予定の実際の結核菌endo 型酵素およびその変異体を用いた、合成糖鎖基質群との相互作用解析を行い、切断位置特異性についての構造化学的知見を得る計画である。糖残基が単一なオリゴ糖であるので、構造解析はより困難になると予想しているが、結果次第で結合解析用のプローブを設計しなおすことも必要になると予想している。
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| Causes of Carryover |
基質としてのサンプル調整及び、酵素切断による検証を少し時間をかけて行い、そのため、実際のNMR測定用の基質の特定までに至っておらず、測定が次年度以降にずれ込んだため。本年度以降に、本格的に測定をスタートしたいと考えており、そのための装置利用の受益者負担費として使用したいと考えている。また、リガンド特定に関する成果も国際学会などでの報告を行う計画であり、その参加費用として使用したいと、考えている。
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