2019 Fiscal Year Research-status Report
Study on synthetic glycans complexed with glycosidase foe NMR analysis of the active site
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18K05345
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (70342748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
張 恵平 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 研究員 (10462706)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 合成糖鎖 / 酵素 / 糖鎖-タンパク質複合体 / NMR / 相互作用解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、アラビナン分解酵素の基質オリゴアラビノフラノシド誘導体の調製、合成したオリゴα-L-アラビノフラノシド糖誘導体の構造解析、および還元末端に質量分析においてタグとなるアセトニド基を導入したオリゴ糖誘導体を基質として用いたエンド型アラビナン分解酵素による切断実験において、分解物の解析にて切断部位を解析、考察し、酵素の基質特異性、切断機構に関する知見を得た。結合位置、活性中心を含むアラビナン結合サイトの解明のため、野生型酵素及び推定している触媒残基及び結合に関与する残基の変異体との結合について、糖側の結合情報を得るためのフローブ合成を引き続き行った。エンド型加水分解酵素によって、主鎖α-1,5 結合の内部が切断され、また、エキソ型加水分解酵素によって、主鎖 α-1,5 結合の非還元末端側から順次切断されていくが、いずれの酵素によっても切断されないプローブとしてα-チオアラビノフラノシドを用いる計画とし、これまでの糖供与体合成を参考に調整した。阻害活性を示したため、測定条件をみて酵素との結合について今後検討していく。連携研究者よりエンド型加水分解酵素類縁体がフルクトース誘導体の分解に関わる新規酵素であることが示唆され、構造解析にて基質構造をフルクトース2糖縮合体と推定し、さらに基質及びチオグリコシド阻害剤を調製した。また、反応条件による立体選択性スイッチが可能な官能基を導入した保護基を有する糖供与体を用い、多様な構造のグルカン類の簡便な合成ルートを見出した。
なお、初年度モデル系にて確立したSTD実験系を用いて、既知のendo型オリゴ糖加水分解酵素と調製した糖受容体基質など種々相互作用を検討した結果、N-アセチルグルコサミン及び分岐糖鎖構造L-フコシル化体などでは結合部位を持つことが示唆されたが、今後さらに、酵素濃度をあげて再測定し、確証を得る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度の基質調製、反応機構解析に引き続き、２年度は、野生型酵素との結合を考慮する阻害剤化合物の調整検討と並行して、モデル糖鎖及びタンパク質を用いた低濃度でのNNMR測定条件の設定検討を進めているが、糖との結合力に応じたタンパク質の濃度調整が重要であろうということが示唆されたところで、後半の自粛状況もあり、進展には困難を極めた。新規ホモログが分解するフルクトース誘導体の構造解析、メカニズム解析へも、本研究課題で計画し、得られた基質合成、阻害剤設計の成果は、応用可能であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本申請では、『合成糖鎖ータンパク質複合体のNMR手法による酵素基質切断部位解析』をテーマに取り上げ、ミコバクテリアの細胞壁複合糖質の合成化学と高磁場NMRの利用で特に糖鎖リガンド側のピーク分解能を最大限に上げることでこれまでにない構造解析を達成しようと計画している。
分析・測定に関しては、ヒト由来糖タンパク質糖鎖フラグメントと関連タンパク 質の相互作用で検討し確立したSTD実験系を用いて、研究代表者が合成を達成している等誘導体と連携研究者より調達予定の実際の結核菌endo型酵素およびその変異体を用いた、合成糖鎖基質群との相互作用解析を行い、切断位置特異性についての構造化学的知見を得る計画である。相互作用を検討すると共に、T1緩和の影響を抑えた反転回転実験から得られるDIRECTION法によるリガンドエピトープマッピングへのアプローチや 15N-HSQCによる化学シフト摂動値マッピングなどによるタンパク質の結合部位の解明についての検討を計画している。
アラビナンは糖残基が単一なオリゴ糖であるので、構造解析はより困難になると予想しているが、今後は解析用にプローブの量的供給を考慮する。結果次第で結合解析用のプローブを設計しなおすことも必要になると予想している。さらに結合に重要な位置以外の近傍での化学修飾により、アフィニティータグ等を導入したプローブの調製、共有結合形成、質量分析による位置解析、分子モデリングでの結合サイトの検証を進めたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
本年度は、後半思うように研究が進められず、測定に関する装置利用の受益者負担費支払いの予定が進まなかったことがひとつの大きな理由である。測定時条件やタンパク質調製と合わせて、本格的に測定をスタートしたいと考えており、そのための装置利用の受益者負担費として使用したいと考えている。また、基質や阻害剤の合成に関する成果も国際学会などでの報告を行う計画であり、その参加費用として使用したいと、考えている。
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