2018 Fiscal Year Research-status Report

ペプチドタグ間の化学反応に基づく相互作用検出を利用した薬剤結合蛋白質の網羅的探索

Research Project

Project/Area Number	18K05348
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	高橋剛群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (90345380)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	オフターゲットタンパク質 / ドラッグ・リポジショニング / βラクタマーゼ / NanoLucルシフェラーゼ
Outline of Annual Research Achievements	薬剤が作用する本来の標的以外のオフターゲット分子を見つけ出すことは、副作用の理解のみならず、異なる作用機序を示す薬剤としての利用（ドラッグ・リポジショニング）も期待できる。申請者はこれまでに、化合物－タンパク質間相互作用を酵素活性を市場として読み出す方法（Interaction-Dependent Native Chemical Ligation and Enzyme Reconstitution; IDNCL-ER）を開発してきている。本研究では、このIDNCL-ER法や、タンパク質トランススプライシング（PTS）を利用した相互作用検出系を用いて、薬剤や薬剤候補化合物が相互作用するタンパク質を網羅的に探索する方法の開発を目的とした。平成30年度は主に、NanoLucルシフェラーゼを検出酵素としたIDNCL-ERを用いて、高脂血症治療薬であるアトルバスタチンと、これに結合するPDE6Dタンパク質を題材として検出系の開発に取り組んだ。アトルバスタチンは、本来の標的タンパク質であるヒドロキシメチルグルタリルCoA（HMG-CoA）還元酵素だけでなく、PDE6Dや、NQO2などとも相互作用することが知られている。そのため、これらのタンパク質との相互作用の検出を試みた。また、PTS法を利用して、βラクタマーゼ活性を指標として薬剤－タンパク質間相互作用を検出する系の開発にも取り組んだ。βラクタマーゼは、βラクタム系抗生物質を分解する酵素であり、これを検出酵素として用いることができれば、抗生物質耐性を指標としてオフターゲットタンパク質の探索ができるものと期待した。実際に、当研究室で開発した分割インテインDnaE変異体を用いて、ペプチド－タンパク質間の相互作用に依存してβラクタマーゼ活性が生成する系の開発を試みた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年は予定通り、NanoLucレポーターを用いたIDNCL-ER法を利用して、高脂血症治療薬アトルバスタチンとタンパク質の相互作用検出系の構築ができ、βラクタマーゼ系の開発にも着手できた。以上から、研究はおおむね順調に進展しているといえる。
Strategy for Future Research Activity	本年度は、引き続き、NanoLucレポーターを用いた検出系を使って、実際にタンパク質ライブラリから薬剤と相互作用するものをルシフェラーゼ発光を利用して検出できるかについて検討する。ここでは、大腸菌を用いたペリプラズム発現系や、ファージを利用した方法、グラム陽性菌を利用した分泌発現系などを利用して、薬剤と発現タンパク質間の相互作用をin vivoで検出する系の開発を試みる。また、βラクタマーゼを検出酵素としたPTS系では、薬剤とタンパク質間の相互作用の有無により、活性型βラクタマーゼが生成するため、これを利用することで、βラクタム系抗生物質によるスクリーニングが可能となると期待される。そこで、実際に上記のタンパク質ライブラリ発現系を用いて、アンピシリン耐性を利用したオフターゲットタンパク質の探索に取り組む予定である。
Causes of Carryover	当初の予定通り研究は順調であるが、課題の2, 3年目の金額が申請時より大きく減額されていたことや、今後消費税が 10％にあがるため、2, 3年目の支出がその分増額することを考慮し、苦しい台所事情ながらも1年目の予算をやりくりをしたためである。