2018 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of development method for fluorescent turn-on probes for lectins
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18K05352
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
金森 功吏 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (90633446)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / 糖鎖受容体 / GFP色素 / turn-on |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞の糖鎖受容体のイメージングや阻害剤探索の基盤技術となる、turn-on型蛍光プローブの開発手法の確立を目指している。in silicoと実際の化合物ライブラリーの合成を連動させた探索法による、種々の糖鎖受容体や他の受容体タンパク質にも適用可能な蛍光プローブ開発を進めている。
申請者はこれまでに、標的レクチンに結合して蛍光応答を示す蛍光プローブ開発に成功している。一方で、これまでの標的レクチン存在下での蛍光応答比は6倍程度にとどまっている。そこで蛍光応答比の向上を目指し、種々のGFP色素誘導体の合成を行って蛍光特性を調べた。また、複数の標的受容体を同時に標的にできるよう、複数色の蛍光波長を有する誘導体の開発を目指したGFP色素誘導体の合成を行った。これらの結果、GFP色素に導入するアミノ基として、これまでのジメチルアミンをアゼチジンやピロリジンに置換すると、グリセロール中での蛍光強度が上昇することを見出した。また、ベンジリデン部位のベンゼン環をジュロリジンに置換し、アミノ基とベンゼン環の間のN-C結合の回転を完全に固定した場合も蛍光強度が上昇することが分かった。また、これらを蛍光プローブに導入すると、レクチン添加時の蛍光応答比が向上することが分かった。
また、標的受容体に結合して蛍光応答を示すプローブを探索する方法として、これまでプローブを固相合成法によって合成した後、固相担体から切り出し溶液中で蛍光強度を測定していたが、ビーズ上にプローブを残したまま蛍光顕微鏡を用いて評価する方法を検討する。そこで、ビーズ上の蛍光プローブを選別する際の最適測定条件を調べるため、蛍光プローブの濃度を種々変えたビーズを合成し、標的レクチンとの蛍光応答を評価する検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度では、ビーズを用いた蛍光プローブの新規探索法に関する検討を開始したほか、蛍光プローブの蛍光応答比の向上並びに複数色化を目指して蛍光色素の合成と蛍光特性評価を行った。蛍光色素の合成に関しては、新たに13種類の誘導体の合成に成功している。これらの中でこれまで用いたGFP色素誘導体と比較して、4化合物についてはこれまでよりも優れた蛍光応答を示した。つづいて得られた蛍光色素をプローブに導入して標的レクチン存在下での蛍光応答比を調べたところ、蛍光応答比はこれまでと比較して最大で約2倍向上した。これらの検討から、蛍光応答比を向上させる置換基の種類について指針を得ることができた。また、芳香族アミンを導入した誘導体において、蛍光極大波長が長波長化した複数の誘導体の開発に成功した。これらを踏まえ、次年度ではビーズを用いたプローブ探索法の開発を進め、蛍光応答比の優れたプローブ探索を順調に進められると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度で検討を進めているプローブ探索法を確立して、プローブライブラリーを合成し、実際の標的受容体に対するプローブ探索するとともに、得られたプローブの構造を元にin silicoによる構造探索を合わせて進める。一方、初年度で得られた蛍光色素の構造－蛍光特性相関研究から、ベンジリデンイミダゾリン骨格のベンゼン環部位に導入するアミノ基によって粘度環境に対する蛍光応答比が変化すること、さらにイミダゾリン環に置換基を導入することで励起状態におけるねじれが抑制され蛍光応答が向上していることを示唆する知見を得ている。次年度では、必要に応じてこれらの知見に基づきさらなる蛍光応答比の優れた蛍光色素の開発を行う。さらに、プローブ探索により得られたプローブを用いて、蛍光顕微鏡を用いたイメージングを行うなど、実践的な応用研究を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
初年度では、蛍光プローブのコアとなる色素の合成を中心に取り組んだが、想定よりも効率よく複数の化合物（約13化合物）の合成に成功したため、次年度使用額が生じた。次年度では、標的受容体や細胞に対して適用可能なビース上でのプローブ合成を行うために必要な固相合成にかかる経費として使用する。さらに、プローブ探索の結果、さらなる色素合成が生じた際に必要な合成のための経費として使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
