2020 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of development method for fluorescent turn-on probes for lectins
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18K05352
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
金森 功吏 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (90633446)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | GFP色素 / turn-on / 蛍光性分子ローター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、糖鎖受容体のイメージングや高感度な阻害剤探索の基盤技術となるturn-on型蛍光プローブの効率的探索手法の開発を進めている。本年度は、１）ビーズ上の蛍光色素―リガンド複合体（蛍光プローブ）にタンパク質を添加し蛍光応答を利用してスクリーニングする検討と、昨年度から引き続き、２）単純な蛍光性分子ローターのモデルを用いた新規蛍光色素の探索と特性評価、３）光親和性標識用残基を導入し、タンパク質と共有結合させて強固に分子内運動を拘束させる方策を考え、修飾GFP色素の合成と、タンパク質存在下での光照射による蛍光off-on制御を検討した。
１）ビーズを用いたスクリーニングの検討では、タンパク質添加時の蛍光変化量の向上の必要性が明らかになったため、固相担体と蛍光プローブを繋ぐリンカーの長さや蛍光プローブの導入量の最適化や、蛍光色素そのものの蛍光応答の向上の検討を進めた。
２）ビアリール骨格に種々の電子供与基と吸引基を導入し光化学特性を調べたところ、新たにメチルスルホンやトリフルオロアセチル基を電子吸引基に用いた際に強い蛍光を有すること、一方興味深いことに、アセチル基を有するビフェニルではほとんど蛍光を示さず、高い光増感能を示すことを見出した。
３）光親和性標識用残基を導入したGFP色素を複数合成した。標的タンパク質として疎水性低分子化合物を吸着するBSA（牛血清アルブミン）を用い、修飾GFP色素が光照射下に共有結合を形成し、蛍光強度の増大を示すか実験を行った。その結果、UVスペクトル変化から共有結合の形成を確認でき、光照射に伴ってほぼ無蛍光から約50倍の蛍光増大に成功した。また、得られたタンパク質をトリプシン分解したところ、蛍光強度が大きく減弱したことから、共有結合していた色素の分子内拘束が解かれ、蛍光がoffになったと考えられる。以上の結果を踏まえ、翌年度の応用展開を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度では、１）のビーズを用いた蛍光プローブのスクリーニングに向けた検討、２）モデルビアリール化合物を用いた新規蛍光色素骨格の探索と蛍光特性評価、３）光親和性標識用残基を導入し、タンパク質と共有結合させて強固に分子内運動を拘束させる方法の開発、の3点を中心に研究を進めた。特に、３）の光親和性標識用の残基を導入したGFP色素誘導体においては、無蛍光状態からモデル標的タンパク質(BSA)の存在下で約50倍の蛍光強度増大に成功しており、これまでの色素の構造探索により達成した蛍光強度増大比約6倍という結果から、大幅に向上させることに成功した。今回開発に成功した光親和性標識型GFP色素にも、これまでに見出した蛍光強度変化を増大させる置換基導入が可能であり、これらの探索も進めてく予定である。また、これまでに開発した蛍光プローブ探索法において、GFP色素の周囲に導入するペプチド残基を適切に選択することで、導入前後で約3倍の蛍光強度増大に成功している。これらの手法は、標的に応じて適切に組み合わせが可能であり、これらの手法を用いて次項に示す計画のもと、次年度の研究を順調に展開できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度では、ビーズ上に合成した蛍光色素ライブラリーから、蛍光応答を利用し高い蛍光応答を示すプローブをスクリーニングする方法（one bead one compound スクリーニング法）の開発を進めるため、ビーズ上での蛍光応答の向上のための種々の条件検討や、今年度開発に成功した光親和性標識用の残基を修飾したGFP色素を用いた検討を進める。また並行して、細胞上の受容体等のタンパク質に対する蛍光プローブ開発も行い、糖鎖受容体のイメージングや、蛍光プローブを用いたディスプレイスメントアッセイによる阻害剤探索のための基盤技術開発を進める予定である。本研究のようなturn-on型蛍光色素を用いたディスプレイスメントアッセイでは、基質認識部位から蛍光色素が少しでも離れると蛍光が鋭敏に消光する性質があり、実際に他研究者の先行研究(Ghadessy, Teo et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 6159－6162.)では、本法を用い、蛍光偏光解消法によるスクリーニングでは見出せないほどの微弱な相互作用のフラグメント化合物(阻害剤の部分構造となるような小さな構造)探索にも成功している。これらの知見を踏まえ、高感度なアッセイ系構築に向けて取り組んでいく予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度では、蛍光応答の向上の必要性から、細胞実験等の詳細な検討を見送り、色素の構造探索を中心に研究を行なったため、計画と差異が生じた。次年度においては、今年度得られた成果をもとに細胞実験等を用いた検討に進む準備ができたため、繰り越した予算を使用させていただく予定である。
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Research Products
(1 results)
